更新时间：2023-04-21 21:25
Bt蛋白中的Bt是细菌Bacillus thuringiensis的缩写。毒蛋白是其产生的一种伴胞晶体，有时也称为delta-endotoxin，即学术刊物中中文所对应“delta 内毒素”。“毒”是指其对特定的物种有毒性，并非对所有的生物体都有毒性。而且不同的Bt菌系产生的毒蛋白的特异性也不同。bt毒蛋白指转基因抗虫作物产生的蛋白质。
Bt基因对二化螟、三化螟、大螟、稻纵卷叶螟、稻青虫等8种水稻鳞翅目害虫具有较高的抗性,是应用最为广泛和最有潜力的毒蛋白基因，其能杀虫的原因在于该基因能使转基因株系合成一种对昆虫有毒的内毒蛋白，Bt菌系含有大量不同的杀虫晶体蛋白编码基因。自1981年第一个杀虫晶体蛋白基因被克隆和测序以来，至今已有近180个不同的Bt杀虫晶体蛋白基因被克隆和测序，并被广泛应用于水稻抗虫改良方面的研究。
我们常说的Bt毒蛋白一般指的是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)产生的杀虫活性成分，Bt菌的杀虫活性成分主要有两类，分别为杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal protein，ICP）和营养期杀虫蛋白（vegetative insecticidal protein，VIP）。其中，杀虫晶体蛋白，ICP，由于其对于靶标害虫特异性强，对人畜安全等优点，现已成为世界上研究最深入，应用最广泛的抗虫基因。ICP本身并不具备毒性，生物实验也验证了其对哺乳动物无害。当ICP被目标昆虫取食后，在昆虫中肠的碱性环境中ICP会被降解为具毒性的活性肽，并与昆虫中肠道上皮纹缘膜细胞上的特异受体相结合，引起细胞膜穿孔，破坏细胞渗透平衡，最终导致昆虫停止取食而死亡。
Bt毒蛋白进入土壤的途径
转Bt作物释放的毒蛋白进入土壤有许多途径，其中最直接的途径包括以下3个方面:1)植株残体，转Bt作物在收割前后遗留在田间的植株残体通过耕作方式向土壤中释放Bt毒蛋白是转Bt作物毒蛋白进入土壤中最重要的途径，尤其是随着作物秸秆还田技术在农业生产上的大面积推广应用，为大量转Bt作物释放的毒蛋白进入土壤并在土壤中累积提供了有利条件。2)根及根系分泌物，转Bt作物的根系也表达Bt毒蛋白，同时其根系分泌物也在源源不断向这些作物根际周围的土壤生物圈中释放着Bt毒蛋白。3)花粉，大多数转Bt作物在花粉中表达Bt毒蛋白，且表达的量很高，并对黑脉金斑蝶有负面影响。因此，转Bt作物的花粉落入田中也是转Bt作物释放的Bt毒蛋白进入土壤中的一条重要途径。
土壤活性颗粒对Bt毒蛋白的吸收
要了解转Bt作物释放的Bt毒蛋白进入土壤后是否会积累并具杀虫活性，其中最关键的是要了解这些Bt毒蛋白进入土壤后与土壤活性颗粒之间的反应。通常这些Bt毒蛋白极易与土壤活性颗粒结合，且不易分离。试验表明，纯化的Btk毒蛋白CryⅠ(66kDa，对鳞翅目昆虫有活性)和Btt毒蛋白CryⅢ(68kDa，对鞘翅目昆虫有活性)能快速(< 30min)吸附并紧密结合在土壤活性颗粒表面上，如与蒙脱石(Montmorillonite(M))表面同K、Na、Ca、Mg或Al离子结合，或与高岭石(Kaolinite(K))表面同Na或Ca离子结合，或与蒙脱石及高岭石表面上的两种三价铁的氢氧化合物聚合体结合，或结合在不同土壤的粘粒表面上。这种结合态一旦达到平衡态就很难被蒸馏水冲刷析出，即使增加冲刷次数最多也只有10%～ 30%游离态的毒蛋白能被冲刷析出。分析表明，这种结合态并没有改变Bt毒蛋白原有的结构。
Bt毒蛋白也能快速地和不同土壤中所提取的腐殖质酸(HAs)结合，这种结合作用和HAs不同官能团的内含物有关[3]。据最新报道，蒙脱石-腐殖质酸-铝羟基聚合物的复合体(complexes of montmorillonite-humic acids-Al hydroxy-polymers)对纯化的Btk毒蛋白有较强的吸附作用，其中70%发生在吸附作用开始的1 h以内，在达到吸附平衡时可有75%～ 85%的Bt毒蛋白紧密地结合在这个复合体上;这种结合态Bt毒蛋白的复合体亦具有抗蒸馏水和1 mol氯化钠冲刷解析的作用
土壤中Bt毒蛋白的检测
测定转基因作物表达产物的基本方法是酶联免疫法(ELISA，Enzyme-linked Immuno-Sorbent Assay)。但在检测这些残留在土壤中的Bt毒蛋白时，采用的方法不同，检测的结果也有差异。一般除了直接检测Bt毒蛋白和测定其含量外，往往还要结合生物测定法来确定其杀虫活性。
1)Western-blotting印迹法:该方法是检测蛋白质等生物大分子的一项重要技术。但在进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)时由于土壤抽提液中游离态Bt毒蛋白的量很低，检测效果不理想。原因是土壤中游离态的Bt毒蛋白极易与土壤活性颗粒结合，且不易分离。例如，即使转Bt玉米根际周围土壤中毒蛋白的量高达95μg·g- 1，而实际土壤抽提液中Bt毒蛋白的量却很低，不易检测到。
2)斑点印迹酶联免疫吸附法(dot-blot ELISA):该方法操作简单，费用低廉，样品用量少，且其灵敏度与ELISA相当，检测无菌土壤中Bt毒蛋白，最低可测到土壤溶液中约3ng·ml- 1的量。但是，由于该方法在土壤颗粒与Bt毒蛋白的复合体转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上的过程中，不能充分与膜上的抗体接触或在这个过程中部分被冲刷掉，从而降低了定量测定的准确性。
3)流式细胞仪法(Flow cytometer，FCM):该方法不需要把Bt毒蛋白从土壤颗粒上分离和提纯，测定的土壤抽提液中的毒蛋白也不会发生类似于dot-blot ELISA中的“遗漏”现象，其灵敏度和速度以及准确性均优于dot-blot ELISA，还可进行多个样品的检测并易于定量化。
4)ELISA平板试剂盒和QuickStix试剂条快速检测法(www。EnviroLogix。com):该方法是目前已知的较为简便、速度更快和灵敏度较高的一种方法。其中ELISA平板试剂盒是定量测定Bt杀虫蛋白的专用试剂盒，而QuickStix试剂条已用来检测转基因Bt玉米根系分泌物和植株残体释放的毒蛋白以及在土壤中的存留和降解等。
5)生物测定法:该方法是确认土壤中残留的Bt毒蛋白杀虫活性的一种有效手段，具有简单易于操作的特点，只需将含有Bt毒蛋白的抽提液直接加入到敏感昆虫的人工饲料中即可，且灵敏度高，可检测到亚致死剂量的Bt毒蛋白[25]。如Bt CrylA毒蛋白在食物中为0。5 ng·ml- 1时就能明显抑制烟芽夜蛾Heliothis virescens幼虫的生长。
存留
试验证明，转Bt作物释放的Bt毒蛋白同商业Bt生物制剂一样，在土壤中不会保持较高的量，但仍有少量与土壤活性颗粒结合残留在土壤中达几周或几个月，由此使非目标土壤生物体有可能接触到这些残留的毒蛋白，如果长期重复种植这些转Bt作物，就可能会造成Bt毒蛋白在土壤中的积累，破坏土壤生物多样性，并最终威胁到整个土壤生态系统[21]。目前，Bt毒蛋白在土壤中存留的时间长短因不同的材料、试验方法和条件而不同。
土壤中Bt毒蛋白的降解与土壤的pH值、土壤中粘土矿物质含量以及微生物活性等有关。在pH值为中性的土壤中，生物测定法显示转Bt棉花和玉米中的Bt毒蛋白的生物活性被很快降解。pH值较低和粘土矿物质含量高的土壤不利于生物的降解，而土壤中微生物的活性越高降解作用越快。Saxena等通过室内研究转Bt玉米中的Cry1Ab毒蛋白在土壤中的垂直运动时发现，柱状体容器中的土样含有粘粒越高(具有较高的阳离子交换量和较大的特异性表面积)，这种毒蛋白存留在这种柱状体容器上层土壤粘粒表面的时间就越长，且不易被土壤微生物降解;相反，柱状体容器中的土样含粘粒量越低则越容易通过水流等将这种毒蛋白过滤掉。
结合态Bt毒蛋白对敏感昆虫的毒性反应
Saxena等用试管随机装入转Bt玉米根部的土壤(带菌的和无菌的)，然后分别用免疫法和生物活性测定法分析土样中的Bt毒蛋白，发现转Bt玉米根部土壤的样品在25d后免疫反应均呈阳性，烟草天蛾幼虫死亡率为100%(LC50为1。6μg)，相反非转Bt玉米土壤的样品的免疫反应均为阴性，烟草天蛾幼虫的死亡率为零;同样将这种幼虫放置在含有转Bt玉米根系分泌物的培养基上，停止饲喂，2～ 3d后幼虫开始死亡，5d后死亡率达90%～ 95%(LC50为5。2μg)，而不含转Bt玉米根部分泌物的对照培养基上没有幼虫死亡。Saxena等进一步通过原位和体外试验发现，转Bt玉米植株体和根系分泌物释放的Bt毒蛋白能以结合态形式对烟草天蛾和马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata的幼虫保持较强的毒性，其杀虫活性甚至在游离态的毒蛋白之上。此外，对烟芽夜蛾幼虫的试验也同样表明了其较强的毒性反应。
Crecchio等研究指出，纯化的Bt毒蛋白分别与腐殖质酸(HAs)和蒙脱石-腐殖质酸-铝羟基聚合物的复合体的结合态同游离态一样具有对烟草天蛾幼虫的杀虫活性。
结合态Bt毒蛋白对敏感昆虫的杀虫机理
由于转Bt作物释放的Bt毒蛋白与土壤活性颗粒间的结合是一种可逆的物理反应，形成的结合态并没有改变其原有的结构，因而具有与商业Bt生物制剂中的毒蛋白一样的杀虫活性。具体的作用过程和转Bt作物的杀虫机理一样，当这种结合态毒蛋白被敏感昆虫取食后，一旦具有杀虫活性的多肽毒素分子从土壤活性颗粒上分离，然后穿过昆虫中肠道滋养层细胞空隙与消化道上皮细胞纹缘膜上的特异性受体结合，从而影响中肠道细胞结构，诱导细胞膜产生非特异性小孔，破坏昆虫体内的离子平衡和渗透压平衡，造成细胞裂解，最终使昆虫肠道麻痹停止取食而死亡。
对土壤生物的影响
土壤生物在土壤生态系统中作为消费者和分解者，以不同的方式改变着土壤的物理、化学和生物学特性，并对全球物质循环和能量流动起着不可替代的作用。转基因作物对土壤生物的影响，不仅包括初级基因产品，也包括来自生物和非生物反应所产生的次级产品的影响。土壤中的生物体通过捕食、竞争、对抗或共生作用而相互依存，构成了生物间的动态平衡，一旦环境由于这些转基因产品的释放而发生改变，一些敏感生物体就会快速发生反应，并由此导致其他生物发生反应，破坏土壤生物间原有的平衡，从而影响到整个土壤生态系统。