更新时间:2023-05-04 12:08
LacZ基因是动物细胞内重要的 reporter基因,其产物是β-半乳糖苷酶,其底物为半乳糖苷,当把此底物标记上荧光基团后,即成为底物荧光探针。LacZ基因广泛用于基因表达调控研究中的一种基因。例如,基因克隆中常用的质粒载体PUC 19及噬菌体载体M13系列均带有LacZ基因。
1969年,美国哈佛大学以Beckwith博士为首的研究小组,应用DNA分子杂交技术首次分离到lacZ基因后,该基因逐渐成为了一个广泛应用的报告基因。但是,在秀丽线虫中其主要应用于相对早期的环境暴露以及毒性的评价研究,应用已经很少。LacZ基因编码的β一半乳糖苷酶(简称β-gal)是由4个亚基组成的四聚体,可催化乳糖的水解。Beta-gal比较稳定,用X-Gal为底物进行染色时,呈蓝色,便于检测和观察。LacZ基因的诸多优点使它成为基因工程实验中的一个常用标记基因,比如常用于转化菌株筛选,β-半乳糖苷酶显色反应选择法,即,蓝白筛选。
转基因小鼠实验系统已被广泛用于单一基因功能的研究,如组织特异表达和发育程序的调控。产生转基因小鼠最普遍的方法是将DNA通过显微注射注入受精卵的原核中。在研究小鼠胚胎发育过程中外源基因的时空表达方面,将融合基因注射进入小鼠受精卵原核中更是一条行之有效的途径。
通过上述方法,将SV40早期启动子和LacZ基因形成的融合基因注入原核来研究小鼠胚胎着床前期发育过程中外源基因的表达。发现注入的外源基因从4细胞到胚泡这段时期均有表达;在桑葚胚时期基因表达的胚胎数占所检测胚胎数的百分比最高(38%);另外,表达依靠SV40启动子的存在。
LacZ基因还可做为外源启动子在小鼠早期胚胎发育中是否有功能的指示基因,评估来自不同真核启动子的基因表达情况。Stevens等人构建的融合基因含有可诱导的小鼠MT-1 promoter和LacZ基因,用锌诱导处理后,表明MT-1 promoter从小鼠胚胎发育开始就有功能,它在早至1细胞时期即能通过诱导使其后的LacZ基因表达。Bonnerot等用逆转录病毒感染多能干细胞,通过beta-gal酶活性检测或通过免疫电镜技术,证明了所构建的融合基因nls-beta-Can所表达的蛋白分布在细胞核周围。用原核注射方法所得结果表明,与LacZ基因相融合的几种启动子(SV40e arly,R SV;be ta-actin)在2细胞胚胎中有功能而Mo-MLV启动子则没有功能。
不仅用于研究外源基因的时空表达。LacZ基因还可用于研究某基因转录起始点附近那段区域的DNA序列具有调控因子的作用及其功能如何。用LacZ基因与另一种来自小鼠热休克蛋白基因hsp68的启动子相连构成的融合基因来制造转基因小鼠。
研究结果表明,hsp68基因转录起始点附近664到113之间的序列对成体尾组织和胎儿阶段各种组织中LacZ基因的压力诱导表达(stress-inducible expression)是有效的;融合基因从着床前期胚胎到发育的胚泡阶段为止对诱导不起反应,如同对内源hsp68基因报道的那样;在发育的任何阶段通过原位染色或Northern分析,甚至在内源基因hsp68组成表达的组织中均无组成表达。由此表明,该融合基因,除含有对热和亚砷酸盐诱导有效的序列外,还含有在发育期间控制组织特异性表达的序列。
用携带LacZ基因的重组逆转录病毒载体做为可移动的外显子,可以对哺乳动物细胞未知转录单位进行原位分析。1989年构建了带有LacZ基因的Mo-MuLV无转录能力的病毒衍生物。
Mo-M uL V LacZ,这种逆转录病毒载体可以随机插入许多染色体位点,但在每一个细胞中仅插在一个位点上,该载体处于原病毒状态时缺乏转录活性,当它插入到染色体上适当位置表达LacZ基因时,证明周围染色体区域具转录单位,从而为产物还不知道的各种哺乳动物基因转录单位的鉴定、作用、分离和研究开辟了一条新的道路。
lacZ基因融合表达hsp-16.1转基因品系首先是用于重金属毒性的评价研究。重金属镉暴露湿著激活lacZ基凶融合表达hsp-16.1转基因品系中lac Z报告基因活性,且这种活性可以被一定浓度钙离子所抑制(Guvcn et al,1995)。lacZ基因融合表达hsp-16.1转基因品系不仅仅可以用于评价重金属水溶液暴露所诱发的毒性,还可以用于评价重金属污染土壤样品中的毒性,镉污染土壤处理同样可以激活lacZ基因融合表达hsp-16.1转基因品系中lacZ报告基因活性(Powcr and dc Pomerai,1999)。
进而,lacZ基因融合表达hsp-16.1转基因品系被用于重金属联合暴露毒性的评价研究。虽然高浓度铜或锌污染土壤样品只会诱发lacZ基因融合表达hsp-16.1转基因品系动物m现较微弱的lacZ报告基因活性激活,但是联合施加镉与铜污染的土壤样品诱发lacZ基凶融合表达hsp-16.1转基因品系动物出现相对于单独施加铜更强的lac Z报告基因活性激活,而联合施加镉与锌污染的土壤样品诱发lacZ基因融合表达hsp- 16.1转基因品系动物则出现相对于单独施加锌更弱的lacZ报告基因活性激活(Power and dc Pomcrai,1999)。
在医学方面,利用LacZ基因在哺乳动物中对某些重要蛋白质基因的时空表达和调控进行研究更是蓬勃发展,文献量也增加较快。在哺乳动物中枢神经系统中,翻磷脂(myelin)对于轴突的形态、功能和生长有显著影响。用由髓磷脂基本蛋白基因的启动子与LacZ基因构成的融合基因制成转基因小鼠来研究髓磷脂的时空表达,所得结果也被免疫细胞化学和超微结构的资料所证实。在基因时空表达方面,用类似方法人们还研究了人类zeta-globin基因、人类神经丝H基因、前脑啡肚基因、金属硫蛋白酶组织抑制物(TIMP)基因等。通过同源重组将LacZ基因插入到基因方n位置,从而检查fyn基因在中枢神经系统中的时空表达情况。在基因调控方面,通过利用LacZ基因来分析生肌决定基因myoD DNA的调控元件,从而进一步研究骨骼肌谱系决定的分子基础。