条约共6条，主要内容是：日本承认并尊重德意在欧洲建立新秩序的领导权，德意承认并尊重日本在“大东亚”建立新秩序的领导权；三国保证如缔约国一方受到目前未参与欧战或中日“冲突”中的一国攻击时，应以一切政治、经济和军事手段相援助；上述条款毫不影响各缔约国与苏联现存的政治地位。此外，在三国谈判期间，德日还通过互换照会秘密商定：一旦日英发生战争，德国将以所拥有的一切手段援助日本；德国同意将其由日本委任统治的太平洋地区前殖民地仍由日本管辖，其他地区则在战后先由德国收回，然后再与日本讨论其归属问题，尽可能照顾日本利益，日本为此应向德国提供相应补偿。

第二次世界大战爆发前，德、意、日建立军事同盟的谈判即已开始。但由于希特勒首先要进攻英、法，而日本则试图把侵华战争扩大到苏联，双方目标不一，谈判未获结果。大战爆发后，日本推行“南进”战略，面临可能与美国发生正面冲突的危险，需要德国的配合。正着手进攻英国的德国，也希望日本能在亚洲发动攻势牵制英美。德日为进一步在欧、亚扩大侵略战争，于1940年9月在东京举行谈判，意大利随后也加入谈判，并在柏林签订该条约。作为条约的补充，1941年12月11日，三国又签署了《德意日联合作战协定》。该条约是《反共产国际协定》和《德意日三国同盟条约》的进一步发展，它标志着德、意、日法西斯军事同盟正式形成，加速了苏德战争和太平洋战争的爆发。而随着意大利、德国、日本等法西斯国家在第二次世界大战中陆续战败投降，这个法西斯同盟也被彻底埋葬了。