1929年，正式拜师齐白石，向其求教山水、篆刻。

1929年—1930年，任北京市立一中师范图画教员。

1929年—1937年，任私立京华美术专科学校教员。

1930年，获聘为私立华北大学美术系和私立京华美专教员。另创作作品《牵牛靖蜓图》《隐居图轴》《柳溪清趣图》等。

1930年—1931年，任私立华北大学美术系教员。

1930年—1933年，任北平市立师范学校图画教员。

1930年—1934年，任北平《晨报》“艺圃版”编辑。

1932年2月，与张大千合作创作作品《秋花靖蜓图》，另创作作品《仿黄公望山水卷》《宋元山水草虫》《荷花靖蜓图》。

1933年，作品《秋花蜻蜓图》在《艺林月刊》发表。

1934年1月，在天津参加“时贤书画展”。另任中国文化建设协会北平支部美术委员会主任委员；3月，创作作品《花蝶图》《海棠蜂蝶》；5月，与赵梦朱合作创作作品《园蔬草虫图》；6月，创作作品《秋塘鱼鸟图》《海棠双蝶图》，另在北京中山公园参加“齐鲁画展”，展出作品有《山水》《荷花》等。

1935年，创作作品《双雀图》；11月，与张大千合作创作作品《栗树草虫》，另在北平举办“张大千、方介堪、于非闇书画篆刻联展”。

1936年，在在京中山公园举办个展。

1937年，创作作品《水仙》《竹枝双鸠》《花鸟图》等。

1938年，创作作品《梅鹊图》《梅鹊图》《仿黄荃竹鸠图》等。

1939年，创作作品《双清息禽》《仿马麟暗香疏影》等。

1940年，创作作品《白荷蜻蜓》《沐鸽图》《牡丹双禽》等。

1941年，创作作品《杏花鹦鹉》《蔬菜草虫》《红柿绶带》《箩葡图》等。

1941年—1942年，任伪国立美术专科学校花鸟画教员。

1942年，创作作品《水仙图》等。

1942年—1943年，任伪国立北京国画馆代理秘书。

1943年，创作作品《墨叶牡丹》《绿牡丹》等。

1945年，创作作品《茶梅栖禽》《枝头鸣鹊》《梅雀图》等。

1946年—1947年，任北平《新民报》“北京人”版编辑。

1947年，游雁荡山，创作作品《红荷》《辛夷引蜂蝶》《三折瀑》等。

1948年，创作作品《雁荡山》《翠竹芙蓉》《竹枝栖禽》等。

1949年，创作作品《牡丹图》《鸳嘉藕》《富贵白头》《粉红牡丹》等。

1949年—1959年，任新中国画研究会（现北京中国画研究会）副主席，后任常务理事与经济审核组主任。

1951年，创作作品《海棠》《亭亭玉立》《绶带双清》《秋葵》《山茶蝶舞》等。

1952年，创作作品《白山茶》《瑞雪祥鸽》《朱砂牡丹》等。

1953年，作品《牡丹图》参加全国国画展览会，另创作作品《大芦花》《仙鹤》《桃花春禽》《墨竹喜鹊》《和平万岁》《梅竹锦雉》《辛夷虾蝶》《青松》等。

1953年—1954年，被邀作北京市各界人民代表会代表。

1954年，创作作品《御鹰图》《红杏山鹤》《鞠有黄华》等。

1954年—1959年，任中央美术学院民族美术研究所研究员，北京市文联常务理事、美术组副组长，北京市第一、二、三届人民代表大会代表。

1955年，参加“第二届全国美术展览会”；6月，与齐白石、陈半丁、何香凝等13人集体创作大幅作品《和平颂》献给世界和平大会；另创作作品《黄签珍禽图》《红杏》《美人蕉》《桃花翠鸟》等。

1956年4月，出席全国文化先进工作者会议；另创作作品《红叶鸽子》《红叶小鸟》《白牡丹》《喜上眉梢》《牡丹》《同心》《四喜图》等。

1957年，任北京画院副院长；2月举办“于非阁、张其翼、段履青、田世光、俞致贞写生花鸟画展”；10月，所著《我怎样画工笔花鸟画》出版；另创作作品《梧桐》《山茶蝴蝶》《梅竹双鸠》《红梅白鹊》《烟波红莲》《国香》《白荷》《山茶白头》《杜鹃图》等。

1958年，创作作品《直上青霄》《丹柿图》《牵牛花》《紫凤朝阳》等。

1959年，创作作品《迎春》《迎春图》《喜鹊柳树》《牡丹双鸽》等；7月3日，在北京逝世，享年70岁。

于非闇出身书香世家，接受了来自祖辈的熏陶，钟情于诗文书画。于非闇父亲属内务府正白旗汉军，其母为满族人。

1917年，于非闇长子于乐出生；1922年，次子于和出生；1924年8月，长女于琛出生；1927年，次女于现出生；1930年，三女于璜出生。

于非闇的绘画从明末的陈洪绶入手，对北宋徽宗赵佶的花鸟画最为推崇，且研究有素。加之他对写生对象的朝夕观察、深入体会，才使得自然界的生灵，在他笔下能够栩栩如生，此外，还远承五代、宋元诸家法乳。其书法早年从晋唐楷帖入手，上溯秦汉篆隶，中年以后专攻虞、褚，晚年则以瘦金体著称，可以说绘画、书法都遥接宋徽宗一脉。除学习卷轴画外，又学宋纯丝古朴的装饰手法，使得他的花鸟作品具有一定的装饰性。

于非闇反对过于工巧细密而失掉笔墨高韵和整体精神，作画不墨守成规，敢于创新。白描兰竹水仙，生动传神、秀雅清逸，所画牡丹能将春之花、夏之叶、秋之干萃于一枝。源于现实而高于现实，尽与自然相吻合。

于非闇的花鸟作品用笔刚柔相济，着色艳而不俗，形象刻画细致精微又极富生气。线条挺秀工致有力，设色强烈不失沉稳，典雅清丽不流于娇媚，生动传神又富于装饰趣味。晚年作品在技法上更加多样，或厚实丰艳而不刻不俗，或淡雅清劲却不薄不冷，灵活的思维和丰富的艺术表现，充满着健康饱满乐观向上的审美情趣。

于非闇的工笔画可以概括以下特点和特征：豪迈、空灵、妩媚、纯熟、稳健、精细、细腻、质朴、秀润、古典、微妙等。

于非闇善于借助生活经验进行绘画题材的创新。对前人从未涉及或较少涉及的题材，于非闇能够发现其中意趣。在他的笔下，可以见到鸽子、凤头鹦鹉、美人蕉、大理花、柱顶红、槭木及红叶藤等多种动植物题材。

于非闇的工笔画用线的疏密、粗细、曲直、力度弹性以及虚实变化，讲究用线的“虚入虚出、实入虚出”体现了工笔线条的阴阳美。“逆锋入纸、顺锋切入、收笔回锋”等多种变化，更多地体现了工笔画的节奏和韵律，以及其工整细腻、优美的线条和丰富的色彩。

“于非闇是近现代中国画史上致力于工笔花鸟画研究与创作，并取得重要成就的画家。他的花鸟作品用笔刚柔相济，着色艳而不俗，形象刻画细致精微又极富生气。”（《中国文化报》评）

“于非闇是中国20世纪杰出的工笔花鸟画家。”（《中国美术》评）

“于非闇是20世纪北方‘京派’工笔花鸟画的杰出代表，对现代工笔花鸟画产生过重要影响。”（《中国文化报美术周刊》评）

“于非闇是公认的花鸟画大家，是传统绘画技法的传承者和捍卫者。”（《收藏投资导刊》评）

“于非闇以一己之力改变了工笔花鸟画在近代画坛中的颓势，为20世纪工笔花鸟画的复兴做出了巨大的贡献。”（人民网评）

“于非闇重要的贡献就在于通过他的艺术实践和艺术教育，把工笔花鸟画的精神和技巧继承下来加以发扬光大。这个传统尤其对京派画家，于非闇的贡献可谓非常之大。”（中央美术学院教授邵大箴评）

“于非闇在20世纪中国画历史当中占有很重要的地位，是20世纪少有的几个工笔大家之一。”（中国艺术研究院美术研究所研究员郎绍君评）

“于非闇在近百年的中国绘画史上，就工笔花鸟画这一项来说，他不仅影响了北京画坛，而且在全国也堪称第一。”（中央美术学院教授李树声评）

2023年5月，根据《国家文物局关于颁布1911年后已故书画等8类作品限制出境名家名单的通知》，于非闇被列入“1911年后已故书画类作品限制出境名家名单”，其作品一律不准出境。