2. 甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。

瑞氏染料 830mg或1g

甲醇（AR） 500ml或600ml

○先称干燥（事先放入温箱干燥过夜）瑞氏染料放置乳钵内，用乳棒轻轻敲碎染料成粉末，再行研磨至听不到研芝麻声即呈细粉末，加少许甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳缸内显“一面镜”光泽，而无染料粉粒沉着。

○再加较多量甲醇研磨呈一面镜光亮，静置片刻，将上层液体倒入一清洁储存瓶内（最好用甲醇空瓶），再加甲醇研磨，重复数次，至乳钵内染料及甲醇用完为止，摇匀，密封瓶口。

○存室温暗处，储存愈久，则染料溶解、分解就越好，一般储存3个月以上为佳。

●缓冲液作用：

○染色对氢离子浓度是十分敏感的，据观察pH值的改变，可使蛋白质与染料形成的化合物重新离解。

○缓冲液须保持一定的pH使染色稳定，PBS的pH 一般在***~6.8，

○偏碱性染料可与缓冲液中酸基起中和作用，偏酸性染料则与缓冲液中的碱基起中和作用，使pH恒定。

●缓冲液配制（pH6.4~6.8，弱酸性）：

配方1 ：1% KH2PO4 30ml M/15 KH2PO4 73.5 ml

配方2 ：1% Na2HPO4 20ml M/15 Na2HPO4 26.5ml

H2O(新鲜) 加至1000ml

置室温黑暗处，瓶口密封，防止霉菌污染，如有污染则应报废。

伊红美蓝培养基（eosin-methylene blue medium,简称EMB medium），一般用于检测大肠杆菌。

伊红为酸性染料，美蓝为碱性染料。当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽。而产气杆菌则形成呈棕色的大菌落。

在碱性环境中不分解乳糖产酸的细菌不着色，伊红和美蓝不能结合，故沙门氏菌等为无色或琥珀色半透明菌落。金葡菌在此培养基上不生长。

常用的伊红美蓝乳糖培养基，可用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌。如果有大肠杆菌，因其强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，菌体带H+，故菌落被染成深紫色，从菌落表面的反射光中还可以看到金属光泽。

用伊红美蓝培养基鉴定水中大肠杆菌

步骤如下：

①制作伊红美蓝培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。

②用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1：10稀释。

③取0.1毫升稀释液接种于伊红美蓝培养基上。用平板划线分离法进行分离。

④将划线后的培养皿倒置37℃温箱中培养18～24小时。培养基中会出现大肠杆菌菌落，菌落中心呈暗蓝黑色，发金属光泽。

⑤将菌落接种于斜面培养基上（由营养琼脂培养基制成）。

配方：

蛋白胨 10g

乳糖 10g

磷酸氢二钾 2g

琼脂 20~30g

蒸馏水 1000ml

2%伊红水溶液 20ml

0.5 %美蓝水溶液 13ml

储备培养基的制备：

先将琼脂加至900ml蒸馏水，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整PH为7.2~7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器内以115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。

制法：

将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正PH，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50～55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。