(3)应用范围广，可适应多种检测条件；

(4)可以进行多项检测，若阳性样本比较难获得，多项检测可以节省样品，降低成本；

(5)标记物稳定，标记样品在4℃贮存两年年以上，无信号衰减现象；

(6)胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，省却了酶标的致癌性底物及终止液的步骤，对人体无毒害。

根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法如下。

1．枸橼酸三钠还原法

（1）10nm胶体金粒的制备：取0.01%HAuCl4水溶液100ml，加入1%枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色。

（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.01%HAuCl4水溶液100ml，加入1%枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min～30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml，混匀即可。

（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01%HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1%枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nm。

2．鞣酸—枸橼酸钠还原法

A液：1%HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。

B液：1%枸橼酸三钠4ml，1%鞣酸0.7ml，0.1Mol/L K2CO3液0.2ml，混合，加入双馏水至20ml。

将A液、B液分别加热至60℃，在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5nm。

3．制备高质量胶体金的注意事项

（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。

（2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（0.45mm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。

（3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。

（4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。

（5）氯金酸配成1%水溶液在4℃可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。

胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。

1．待标记蛋白溶液的制备 将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1h，去除聚合物。

2．待标胶体金溶液的准备 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。标记IgG时，调至9.0；标记McAb时,调至8.2；标记亲和层析抗体时，调至7.6；标记SPA时，调至5.9～6.2；标记ConA时，调至8.0；标记亲和素时，调至9～10。

由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。

3．胶体金与标记蛋白用量之比的确定

（1）根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml。

（2）将标记蛋白（以IgG为例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5mg/ml～50mg/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加1ml稀释液。

（3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10%NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。

（4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10%～20%。

4．胶体金与蛋白质（IgG）的结合 将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5%胎牛血清（BSA）和1%聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5%BSA使溶液终浓度为1%；1%聚乙二醇加至总溶液的1/10。

5．胶体金标记蛋白的纯化

（1）超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。

用BSA做稳定剂的胶体金—羊抗兔IgG结合物可先低速离心（20nm金胶粒用1 200r/min，5nm金胶粒用1 800r/min）20min，弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物用6 000g，4℃离心1h；20nm～40nm胶体金结合物，14 000g，4℃离心1h。仔细吸出上清，沉淀物用含1%BSA的PB液（含0.02%NaN3），将沉淀重悬为原体积的1/10，4℃保存。如在结合物内加50%甘油可贮存于-18℃保存一年以上。

为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用10%～30%蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。

（2）凝胶过滤法：此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的1/5～1/10。再经1 500r/min离心20min。取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝胶S-400）层析柱分别纯化。层析柱为0.8 cm×20cm，加样量为床体积的1/10，以0.02Mol/L PBS液洗脱（内含0.1%BSA，0.05%NaN3，pH8.2者用IgG标记物），流速为8ml/h。按红色深浅分管收集洗脱液。一般先滤出的液体为微黄色，有时略混浊，内含大颗粒聚合物等杂质。继之为纯化的胶体金蛋白结合物，随浓度的增加而红色逐渐加深，清亮透明，最后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。将纯化的胶体金蛋白结合物过滤除菌、分装,4℃保存。最终可得到70%～80%的产量。

6．胶体金蛋白结合物的质量鉴定

（1）胶体金颗粒平均直径的测量：用支持膜的镍网（铜网也可）蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。计算100个金颗粒的平均直径。

（2）胶体金溶液的OD520nm值测定：胶体金颗粒在波长510nm～550nm之间出现最大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1%BSA，0.02%NaN3）将胶体金蛋白试剂作1︰20稀释，OD520=0.25左右。一般应用液的OD520应为0.2～0.4。

（3）金标记蛋白的特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色法（MF－IGSSA）。将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或抗原）以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。

胶体金作为免疫标记物始于1971年，由Faulk和Taylor将其引入免疫化学。Faulk 和Taylor首先将兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门氏菌的表面抗原。此后，他们还把胶体金与抗胶原血清，植物血凝素，卵白蛋白，人免疫球蛋白轻链、牛血清白蛋白结合应用。1974年Romano和他的同事们将胶体金标记在马抗人的IgG上，实现了间接免疫金染色法。层析法检测试剂最早出现于1988年，是Unipath公司利用染料颗粒开发生产的一种非常方便使用的怀孕检测试剂。1989年，Spielberg F等发展了以胶体金为标记物用于检测艾滋病毒抗体的渗滤法检测试剂，此后，免疫胶体金在快速检测试剂中得到了广泛的应用和发展，相伴随的层析法检测试剂在组成结构、生产用的材料等方面也取得了长足的进步。

目前市场上见到的典型的层析法检测试剂的组成成份可分为三个部分，其一是多孔材料，包括样品垫、吸水垫、结合垫及硝酸纤维膜；其二是试剂，如抗体、金标结合物等；其三是层压结构及卡盒，如PVC板、双面胶、盒等（见表1及图1）。

层析法检测试剂的各组分，并非简单的相互叠加，改变其中的任一组分，都可能引起产品整体性能的变化。以最常见的早早孕检测试剂为例，影响其产品敏感度的因素可能有：

*硝酸纤维膜的特性，主要反应在其流速上。

*胶体金颗粒的大小，浓度等

*结合垫的性能，金标结合物的量

*样品垫的特性

*检测线的位置及宽度

*硝酸纤维膜和结合垫的叠压强度

*捕获抗体的亲合力

*检测线包被捕获抗体的量

*结合抗体的特性

层析法免疫胶体金检测试剂实际上是免疫金标记技术和抗原抗体反应相结合而形成的一种应用形式，相比ELISA试剂，除标记物不同外，同样服从于抗原抗体反应的特性。此种检测方法具有明显的优点：

*方便使用，体现在操作简单，不需经过特殊培训。

*短时间获得检测结果，一般10－15分钟即可得出结论。

*不同环境下的稳定性好，不需冷藏。

*相比而言，其生产成本和检测成本均较低。

*检测标本种类多：可用于查血、尿液或粪便，因而适合各种检查

胶体金标记技术由于标记物的制备简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，它的应用范围广，除应用于光镜或电镜的免疫组化法外，更广泛地应用于各种液相免疫测定和固相免疫分析以及流式细胞术等。

1．液相免疫测定：将胶体金与抗体结合，建立微量凝集试验检测相应的抗原，如间接血凝一样，用肉眼可直接观察到凝集颗粒。利用免疫学反应时金颗粒凝聚导致颜色减退的原理，建立均相溶胶颗粒免疫测定法（Sol particle immunoassay ,SPIA）已成功地应用于PCG的检测，直接应用分光光度计进行定量分析。

2．金标记流式细胞术：胶体金可以明显改变红色激光的散射角，利用胶体金标记的羊抗鼠Ig抗体应用于流式细胞术，分析不同类型细胞的表面抗原，结果胶体金标记的细胞在波长632nm时，90度散射角可放大10倍以上，同时不影响细胞活性。而且与荧光素共同标记，彼此互不干扰。

3．胶体金固相免疫测定法

（1）斑点免疫金银染色法（Dot－IGS/IGSS）是将斑点ELISA与免疫胶体金结合起来的一种方法。将蛋白质抗原直接点样在硝酸纤维膜上，与特异性抗体反应后，再滴加胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体反应处发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的红色斑点，此称为斑点免疫金染色法（Dot－IGS）。此反应可通过银显影液增强，即斑点金银染色法（Dot－IGS/IGSS）。

（2）斑点金免疫渗滤测定法（dot immuno－gold filtration assay,DIGFA）此法原理完全同斑点免疫金染色法，只是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。