双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。

切口平移法(nick translation) 利用微量的DNA酶Ⅰ使待标记的双链DNA分子产生若干切口，然后利用DNA聚合酶Ⅰ的5'→3'外切酶活性从从切口的5'端除去核苷酸；同时DNA聚合酶Ⅰ还有5'→3'的聚合酶活性可将反应体系中的核苷酸底物连接到切口的3'羟基末端。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,此时若反应体系中含有标记的核苷酸，它们就会掺入到新合成的链中，获得带有标记的DNA探针。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。

切口平移反应受几种因素的影响:

(1)探针的大小及比活与DNA酶Ⅰ的用量直接相关，酶量过多会造成切口过多,探针长度下降而且还会引起新合成的标记链被切开。所以，DNA酶Ⅰ的用量不宜过多。