吴研因幼年就读于私塾，光绪二十九年（1903）入上海半淞园师范讲习所学习，3年后回江阴任立本小学教员、单级部主任。1911年吴研因和刘半农等编辑《江阴杂志》，1912年参与创办《江阴报》，1916年任上海中华书局编辑、上海商务印书馆国文教材编辑主任，兼任尚公小学校长，后任江苏省立第一师范学校教员兼附属小学主任，1918年任附小校长。其间，他和俞子夷等一起首创用白话文编写全套小学教材，深受教育界重视。他编的《新学制小学国语教科书》和《小学历史自习书》风行全国。

1928年，就任教育部国民教育司第一科科长，反对小学读经，为推行白话文教材据理力争。1929年吴研因任教育部教育方案编制委员会党义教育组委员，1931年参加由蔡元培、朱经农等主编的《最近三十五年之中国教育》一书的编写工作，1935年任全国义务教育委员会委员，同年9月与叶圣陶、王志瑞等发起编写《小朋友文库》，旨在为小学生提供合适的课外读物。1941年11月，吴研因以华侨教育专员的名义被派至菲律宾考察，后任菲律宾华侨中学教员兼教导主任。抗日战争胜利后返南京，任教育部国民教育司司长。