1589年11月23日，安妮和詹姆斯在奥斯陆的老主教官邸正式结婚。为了让新娘和新郎都能听懂，利斯牧师大卫·林赛用法语主持仪式，把安妮描述成“一位既虔诚又美丽的公主……她对陛下非常满意。”庆祝活动持续了一个月，12月22日，詹姆斯带着50名随从在埃尔西诺的克伦堡宫拜访了他的新亲戚，新婚夫妇在此地受到了12岁的克里斯蒂安四世国王、索菲王太后和克里斯蒂安国王的四位摄政王的欢迎。这对夫妇于3月7日继续前往哥本哈根，参加了安妮的姐姐伊丽莎白与不伦瑞克公爵海因里希·尤利乌斯的婚礼，两天后，他们乘坐修补过的“基甸号（Gideon）”前往苏格兰。两人于5月1日抵达利斯河。在詹姆斯·埃尔芬斯通用法语发表欢迎演说后，安妮待在国王的军火库（King's Wark）内，詹姆斯则独自去教区教堂听帕特里克·加洛韦德布道。五日后，安妮乘坐一辆从丹麦带来的纯银马车进入爱丁堡，詹姆斯骑着马并排而行。

1590年5月17日，安妮在荷里路德宫的亚贝教堂加冕——这是苏格兰历史上举行的首个新教加冕礼。在7小时的仪式中，马尔伯爵夫人为安妮解开长袍，主持仪式的牧师罗伯特·布鲁斯将“一定量的油”倒在“她的胸部和手臂上”，以此为她受膏让她成为王后（苏格兰教会的牧师强烈反对加冕礼中的这一程序，他们认为这是异教徒和犹太教徒的仪式，但詹姆斯坚持认为这一仪式可以追溯到《〈圣经〉旧约》）。国王将王冠交给大臣梅特兰，梅特兰再把王冠戴在安妮头上。随后，安妮宣誓捍卫真实信仰和神崇拜，并“蔑视和经受住所有天主教迷信以及任何违背圣言的典礼和礼节。”

据各方面记述，詹姆斯起初被他的新娘迷住了，但他的迷恋很快就消失殆尽，并且这对夫妇经常争执不下，不过在刚结婚的那几年，詹姆斯似乎总是带着耐心和钟爱之情对待安妮。在1593年至1595年期间，詹姆斯与安妮·里昂有恋爱关系，他在诗中将安妮·里昂称作“我的情妇和我的爱人”；并且安妮自己有时也会成为流言蜚语的对象。在《Basilikon Doron》一书中（该书创作于1597年至1598年期间），詹姆斯把婚姻描述为“世上最大的幸事或惨事，这会降临到每个男人身上。”自从结婚的第一刻起，安妮就承受着为詹姆斯和苏格兰生育继承人的压力，但是，随着1591年和1592年的流逝，安妮没有任何怀孕的迹象，这使长老会重新开始诋毁詹姆斯钟爱男性。当安妮于1594年2月19日生下她的第一个孩子亨利·弗雷德里克·斯图亚特时，公众得到了极大的安慰。

安妮很快意识到，她在照顾儿子方面没有发言权。詹姆斯将他的前保育员海伦·利特尔任命为育儿室负责人，海伦将亨利安置在詹姆斯自己的橡木摇篮里。最令安妮痛苦的是，詹姆斯按照苏格兰王室的传统，坚持要让亨利在马尔伯爵约翰·厄斯金的监护下在斯特灵城堡生活。1594年底，安妮展开了一系列激烈的活动来争夺亨利的抚养权，她招募了一批支持者，其中包括苏格兰御前大臣约翰·梅特兰。詹姆斯担心安妮可能会竭尽全力，他以书面形式正式通知马尔伯爵决不允许把亨利交给任何人，除非有他亲口下达的命令，“因为在我儿子的保证人中有我的保证人”，即使他本人过世，也不准把亨利交给王后。安妮要求将此事交由委员会裁决，但詹姆斯不肯。詹姆斯让安妮为此事动怒和流泪，当众失态后，安妮变得极为心烦以至于她在1595年7月流产。此后，安妮表面上放弃争夺抚养权，但人们认为此事对他们的婚姻造成了永久性伤害。1595年8月，约翰·科尔维尔写道：“除了被狡猾的掩饰掩盖的潜藏仇恨，国王和王后之间什么也没有，他们都有意冷落对方。”尽管如此，王后又为詹姆斯生了6个孩子。

随着伊丽莎白一世的离世，安妮看到了一个迟来的机会，当詹姆斯带着马尔伯爵前往伦敦继承英格兰王位时，安妮于1603年取得了亨利的监护权。当时，身怀有孕的安妮带着一群鼎力相助的贵族突袭了斯特灵城堡，一心想把9岁的儿子亨利带走，她已经与儿子5年未见。但马尔伯爵的妻子和儿子只允许她带不超过两个随从进入城堡。守卫的冥顽不化让安妮大发雷霆，导致她再度流产：根据大卫·考尔德伍德的说法，她“气冲冲地上床睡觉，于5月10日失去了孩子。”当马尔伯爵带着詹姆斯的指示（即让安妮前往英格兰王国与他汇合）返回苏格兰时，安妮写信告诉詹姆斯，她拒绝这样做除非允许她获得亨利的监护权。历史学家波琳·克罗夫特描述的这种“强有力的母性行为”最终迫使詹姆斯服输，尽管詹姆斯在写给马尔伯爵的信中将安妮的行为描述为“任性嚣张”。

不幸流产的安妮在度过了短暂的康复期后，按时与亨利王子一同南下。他们的南下之旅在英格兰引起了轰动，安妮·克利福德夫人记录到，她和她的母亲为了见王后急忙杀了三匹马，当詹姆斯在温莎附近与安妮见面时，“有无数的贵族和女士，和一个我认为将永远不会再见到的如此庞大的宫廷。”

观察家经常注意到安妮和詹姆斯之间夫妻关系不和的事件。在1600年所谓的高里阴谋中，年轻的第三代高里伯爵约翰·鲁思文及其弟弟亚历山大·鲁思文因一次针对国王的所谓的袭击被詹姆斯的随从杀死。结果导致他们的姊妹，在安妮身边担任宫廷女侍的比阿特丽克斯·鲁思文和芭芭拉·鲁思文被解雇。怀孕5个月的王后拒绝下床，除非她们被恢复原职，安妮在床上呆了两天，也拒绝进食。当詹姆斯试图命令她时，安妮警告他要慎重对待她，因为她不是高里伯爵。詹姆斯暂时通过请一位著名的杂技演员给她带来娱乐以平息她的怒气，但安妮从未放弃，并且在接下来的三年内，安妮对鲁思文家族的顽固支持被政府视为安全问题，给予了足够的重视。1602年，在发现安妮把比阿特丽克斯·鲁思文偷偷运到了荷里路德后，詹姆斯盘问了整个宫室；1603年，詹姆斯最终决定给比阿特丽克斯·鲁思文200英镑的退休金。

1603年，这对夫妇就计划组建安妮的英格兰宫室一事发生冲突。安妮收到消息，“陛下认为她持续不断的任性非常可憎。”相应地，安妮也厌恶詹姆斯酗酒：1604年，她向法国使节倾诉道，“国王喝那么多酒，导致疾病缠身，我期待早日看到恶果。”1613年，安妮在打猎时射杀了詹姆斯最喜欢的狗，引发了一场短暂的冲突。起初，詹姆斯怒不可遏，随后为了纪念那只叫“宝石”的狗，詹姆斯将一颗价值2000英镑的钻石送给安妮，才使事情得以化解。

在伦敦，安妮采取世界性的生活方式，但詹姆斯更喜欢逃离首都，经常呆在他位于罗伊斯顿的狩猎小屋。安妮搬进了格林尼治宫，随后又移居萨默塞特府，后被安妮更名为丹麦府。1607年以后，她和詹姆斯很少住在一起，当时，她已经生了七个孩子，并且至少流产了三次。1607年，安妮的最后一个孩子索菲亚在出生时勉强存活，但她仅活了一日，此后，安妮决定不再生育，此举可能扩大了她和詹姆斯之间的鸿沟。安妮与詹姆斯的长子亨利于1612年离世，年仅18岁，可能死于伤寒；他们的女儿伊丽莎白于1613年4月在与普法尔茨选帝侯弗里德里希五世结婚后前往海德堡；这使捆绑安妮和詹姆斯的家庭纽带被进一步削弱。亨利的离世对安妮的打击尤为沉重，有人劝威尼斯大使不要向安妮表达慰问，“因为她不忍说起此事，每回忆起此事她都会泪水涟涟和唉声叹气。”从此以后，安妮的健康状况不断恶化，她退出了文化活动和政治活动的中央舞台，于1614年举行了最后一次假面舞会。安妮对詹姆斯的影响明显减弱，因为他开始公开依靠有权势的宠臣。

詹姆斯一直在廷臣中挑选男宠，甚至鼓励他们在政府中发挥作用。安妮对詹姆斯的两个宠臣萨默塞特伯爵罗伯特·卡尔和后来的白金汉公爵乔治·维利尔斯的反应完全不同，他们在詹姆斯统治英格兰的后半段占据支配地位。安妮憎恶卡尔，但她支持维尔利斯崛起，在安妮的卧房内，詹姆斯封维尔利斯为爵士；安妮与维尔利斯发展了友好关系，她称维尔利斯为“狗”。即便如此，在白金汉公爵得势后，安妮发现自已越来越被忽视，并在她生命历程走完之前成为了一个孤独的人。

在苏格兰时，安妮有时会利用宫廷内的派系争斗来达到自己的目的，特别是借助支持马尔伯爵的仇敌。因此，詹姆斯不会向她泄露国家机密。第一代北安普敦伯爵亨利·霍华德巧妙地提醒詹姆斯，尽管安妮具备一切美德，但夏娃也会被蛇哄诱。詹姆斯的另一位秘密通讯员罗伯特·塞西尔认为“王后性格懦弱，是聪明人和无良者手中的工具。”实际上，安妮似乎对高层次政治没什么兴趣，除非它们涉及到其子女和朋友的命运。然而，1600年11月，罗伯特·塞西尔急于查清安妮与西属尼德兰总督阿尔布雷希特七世的通信内容。

在英格兰时，安妮主要从政治活动转向社会和艺术活动。尽管安妮充分参与了詹姆斯的宫廷生活，并保留了她自己的宫廷，她的宫廷也经常吸纳那些不受詹姆斯欢迎的人，但她很少采取反对丈夫的政治立场。不管安妮与詹姆斯之间有什么私人纠葛，她在英格兰证明了自己是詹姆斯的外交财富，在公众面前表现得既谨慎又和蔼。例如，安妮在向大使和外国拜访者传递斯图亚特王朝和奥尔登堡王朝的威望方面起到了关键作用。

从1615年5月起，正如贝德福德和罗克斯伯勒伯爵夫人在信中所描述的那样，安妮的脚开始疼痛。到1617年底，饱受病痛折磨的安妮变得非常虚弱，写信者约翰·张伯伦记录到：“王后依旧在病中，尽管她乐意把所有的病症都归咎于通风，然而，她的大多数医生担心不良习惯和性情会进一步给她的整个身体带来不变。”1619年1月，御医西奥多·德·梅耶恩让安妮通过锯木来改善她的血流情况，但安妮的病情却因此恶化。在安妮最后一次生病期间，詹姆斯只探望了她三次，不过，当安妮失明时，他们的儿子查理经常在汉普顿宫毗连的套间内就寝，在安妮生命中的最后几个小时内，查理也守在母亲的床边。陪着安妮直到最后一刻的是她的私人女仆安娜·鲁斯，她于1590年跟随安妮从丹麦来到英国。1619年3月2日，安妮因水肿离世，享年44岁。尽管詹姆斯疏于照顾安妮，但他在感情上依旧受到妻子离世的影响。詹姆斯在安妮临死的那些日子里没有去看望她，也没有参加安妮的葬礼，因为他生病了，根据西奥多·德·梅耶恩的记录，詹姆斯出现的症状包括“昏倒、叹息、恐惧、难以置信的忧伤……”1619年5月13日，安妮被安葬在威斯敏斯特大教堂亨利七世礼拜堂内。

安妮和詹姆斯都是挥霍无度之人，不过她花了几年时间才把相当多的嫁妆花光。安妮喜欢跳舞和盛装游行，这些活动经常不被苏格兰长老会接受，但她在雅各宾时代（即詹姆斯一世/六世统治时期）的伦敦找到了施展的机会，她在英格兰的王室宫廷内营造了一种“富有且好客”的文化氛围，成为了一名狂热的戏迷，并赞助了耗资巨大的假面剧。沃尔特·科普受罗伯特·塞西尔受邀在安妮的弟弟乌里克·约翰到访期间为王后挑选戏剧，他写道：“伯比奇来了，他说没有王后未曾看过的新剧，但他们重新上演了老剧《空爱一场（Love's Labour's Lost）》，他说剧中的俏皮话和笑料会让她非常满意。”安妮的假面剧在舞台和表演上达到了前所未有的高度，受到了外国大使和权贵的狂热追捧，并有力地展示了英国在欧洲的重要性。

安妮的假面剧几乎包揽了十七世纪前二十年所有的宫廷女性表演，对女性表演史具有决定性影响。安妮有时会和侍女一起参演假面剧，偶尔也会冒犯观众。在1604年的《The Vision of the Twelve Goddesses》中，安妮饰演帕拉斯·雅典娜，她穿着一件被一些观察家认为过短的无袖上衣；1605年，怀着六个月身孕的安妮参演了假面剧《The Masque of Blackness》，她和侍女因把皮肤涂成黑色而引起了一些流言蜚语。写信者达德利·卡尔顿报告说，后来，当安妮与西班牙大使跳舞时，他吻了她的手“尽管有在他嘴唇上留下痕迹的危险”。安妮委托当时的顶尖人才创作这些假面剧，其中包括本·琼森和伊尼戈·琼斯。

琼斯也是一位非常出色的建筑师，他为安妮在格林尼治设计了王后宫，这是英格兰最早的帕拉第奥式建筑之一，荷兰发明家萨洛蒙·德·卡乌斯在格林尼治和萨默塞特两地为安妮规划花园。安妮特别喜欢音乐，并资助了曾在丹麦宫廷受雇于她弟弟的琉特琴弹奏者兼作曲家约翰·道兰，以及许多优秀的法国音乐家。安妮还雇佣了保罗·范·索梅尔、艾萨克·奥利弗和丹尼尔·米登斯等艺术家，他们在视觉艺术方面领导了一代英国人的品味。在安妮手下，英国皇室典藏再次增加，她的儿子查理一世也继续延续了这项事业。

安妮生了七个孩子，其中四个在婴儿期或早期儿童期夭折；她还至少流产了三次。她的次子接替詹姆斯成为英国国王查理一世。她的女儿伊丽莎白·斯图亚特是波希米亚的“冬后（Winter Queen）”，也是英国国王乔治一世的外祖母。