1929年9月5日生于楚瓦什自治共和国马林斯基波萨德区绍尔舍雷村。1947年毕业于马林斯基波萨德林业学校。1950年参加苏军。1954年在伏龙芝市军事航空飞行学校毕业后，在莫斯科军区歼击航空兵部队任资深飞行员。1957年加入苏联共产党。1960年3月进入航天飞行队。苏联第一位航天员尤里·加加林和第二位航天员戈尔曼·季托夫都只上过太空一次，而尼古拉耶夫却参加过两次航天飞行。

1962年8月11－15日，尼古拉耶夫驾乘“东方－3号”航天飞船升空，并同第4位航天员帕维尔·罗曼诺维奇·波波维奇驾驶的、于8月12日进入轨道的东方4号飞船进行了70小时24分钟的编队飞行，这是世界上两艘载人飞船在太空第一次长时间“并肩飞行”，首次试验了两艘飞船乘员在太空的无线电联络，相互摄影，并完成了预定的科学技术和医学生物学方面的实验计划。尼古拉耶夫还运用手动操纵系统进行了飞船的空间定位。他于8月15日乘坐东方3号飞船返回地面，共绕地球64圈，创造了90小时22分钟的太空飞行纪录。 由于他顺利地完成了首次长时间在宇宙空间的编队飞行，于1968年8月18日被授予“苏联英雄”称号和技术科学副博士学位。