实验中一般采用取代型或插入型载体在ES细胞中根据正-负双向选择（positive-negative selection，PNS）原理进行完全基因敲除实验。正向选择基因neo通常被插入载体靶DNA功能最关键的外显子中，或通过同源重组法置换靶基因的功能区。neo基因有双重作用，一方面形成靶位点的插入突变，同时可作为正向筛选标记。负向选择基因HSV-tk（human semian virus-thymidinekinase）则被置于目的片段外侧，含有该基因的重组细胞不能在选择培养基上生长。如果细胞中发生了随机重组，负向选择基因就可能被整合到基因组中，导致细胞死亡。由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为10-2～10-5，植物的概率为10-4～10-5，即使采用双向选择法也很难保证一次就从众多细胞中筛选出真正发生了同源重组的胚胎干细胞，必须用PCR及Southern杂交等多种分子筛选技术验证确实获得了目的基因被敲除的细胞系。