尹斗寿的父亲是军资监正尹忭，有一弟尹根寿。早年师从李仲虎和李滉。1555年中生员试一等，1558年式年文科乙科及第，入承文院，历任检阅、正字、著作等职。1563年与朴素立、奇大升一起反对任吏曹正郎的权臣李梁举荐自己的儿子李廷宾任吏曹佐郎（均为铨郎职），因此受到大司宪李戡的弹劾而辞职。但当年在领议政尹元衡、右议政沈通源的请求下，免除罪名，再次叙用为弘文馆修撰。

此后历任吏曹正郎、议政府检详、舍人、司宪府掌令、成均馆司成、司仆寺正等职。1565年在文定王后的推荐下任弘文馆副应教，此后历任承政院同副承旨、右承旨，1576年官至大司谏。翌年以谢恩使赴明，回国后任都承旨，随后受表弟李铢之狱的牵连，与弟弟尹根寿一起被罢职。不久在大司宪金继辉的请求下复职，外放延安府使。后历任汉城左尹、五卫副总管、刑曹参判等职，1587年倭寇入侵全罗道后，他被派为全罗道观察使，以镇定人心。1589年调任平安道观察使，同年因曾出使明朝、为宗系辨诬出过力，被策为二等光国功臣，封海原君。