1950年出生于韩国全罗南道光山郡（现光州广域市光山区），1978年从全南大学政治与外交系毕业，1979年与朴基顺（女）等人组织了“野火夜校”，向工人们传授知识。尹、朴二人此时为一对情侣，然而同年12月26日，朴基顺便因煤气中毒意外去世，享年22岁，而此时，保安司令部司令全斗焕发动了双十二政变，也就是首尔之春（汉城之春）。其新军部（一心会）成为了新的领导人，为镇压民主浪潮，全斗焕政权于5月18日派出陆军空降部队镇压光州的大规模示威，造成数百光州市民死亡，是为光州事件。

1980年518光州民主化运动期间，尹祥源担任民主斗争委员会发言人。5月27日，在全罗南道民政厅2楼被戒严军队枪击身亡，死时只有29岁。而对于死因，虽然出现了刺伤、烧伤和枪击等多种说法，但根据目击者的证言，最终确认为枪击。尹祥源死后，着火的窗帘落在尸体上，而留下了烧伤痕迹。