更新时间：2024-05-21 13:47
插入失活法，英文名称是insertional inactivation，用于重组DNA分子。
插入失活(insertional inactivation)
从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活(insertional inactivation) 。插入失活法是从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子（筛选）的主要方法。
外源DNA片段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法。
1.抗性基因插入失活筛选法
根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法是重组体常用的筛选方法。如非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的, 表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。但是, 如果在该质粒的四环素抗性基因内插入外源片段, 就会造成四环素抗性基因失活, 变成AprTcs, 携带这种质粒的宿主菌可以在氨苄青霉素的平板上生长, 而不能在四环素抗性平板上生长。
2. 蓝白斑筛选法
根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法需要进行菌落平板的影印复制, 才能够将所需的重组体挑选出来, 大大增加了筛选的工作量。后来, 人们设计了以β-半乳糖苷酶的产生作为颜色筛选标记的载体, 简化了筛选程序, 提高了灵敏度。 这类载体系统包括M13噬菌体、pUC质粒系统、pEGM质粒系统。它们的共同特点是载体上携带一段细菌的lacZ基因, 它编码β-半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的α-肽, 载体转化的受体菌为lacZΔM15基因型。这样, 载体同宿主通过互补, 具有完整的β-半乳糖苷酶的活性。如果在载体的lacZ基因中插入外源DNA, 造成lacZ基因失活, 不能合成α-肽, 失去同宿主的互补, 不能形成有功能的β-半乳糖苷酶, 失去分解X-gal的能力。在X-gal平板上, 含阳性重组体的细菌为物色菌落(质粒载体)或无色噬菌斑(M13噬菌体载体); 非重组体转化的细菌为蓝色菌落或蓝色噬菌斑。显色反应筛选方法比较简单, 但是β-半乳糖苷酶的合成需要诱导。实验中起诱导作用的是安慰诱导物--IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷), 作用底物是X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。通常是将X-gal和IPTG混合后, 涂布在固体平板的表面。