美术馆奠基于16世纪初，即教皇朱利阿斯二世时代。他起用心仪的米开朗基罗和拉斐尔等艺术家来装饰宫殿，为后代世人留下文艺复兴时期伟大的杰作。18世纪时，克莱门斯十四世与比奥六世收藏了古代雕刻品，建构了今天梵蒂冈美术馆的一角比奥·克莱门蒂诺美术馆的基础。到了19世纪，比奥七世收集古代罗马的遗物，格里高利十六世又收集伊特鲁立亚美术等，就此，历代教皇的藏品日益丰富。“耶和华的仆人之家”经过六百多年，收藏了质与量都惊人的美术品，它们被置于一千四百个厅堂。只要依循拉斐尔、达·芬奇、卡拉瓦乔等巨匠的作品参观，意大利的绘画发展史便已清晰可见了。