分子式：C21H20O11

分子量：448.3769

槲皮苷作对照品测定总黄酮的含量

香柏为柏科圆柏属植物，主要用于园林装饰，其叶中较多的挥发油用作香精的原料。柏科圆柏属植物中主要含有：挥发油 、黄酮、萜类等成分。从香柏水提取物中分离纯化出13个化合物，其中双黄酮2个，5个黄酮；初步的HPLC分析结果表明槲皮苷含量较大。该属植物中的总黄酮具有清除DPPH自由基活性能力。下面为香柏总黄酮含量测定方法，为香柏总黄酮的含量测定提供科学依据。

1 实验材料

香柏样品于2008年8月采自四川小金县，经鉴定为柏科圆柏属植物香柏。槲皮苷从香柏中分离纯化，其结构经Ms，UV，IR，HNMR，CNMR等波谱进行表征，纯度经HPLC分析大于99.5%。

通用UV-1901紫外分光光度计，METTLER AE24O电子天平，其余试剂均为国产分析纯。

2 实验方法及结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取在50℃下，真空干燥至恒重的槲皮苷标准品35.02mg，用无水乙醇溶解，定容至100ml，配制成浓度为0.35mg/ml的对照品溶液。

2.2 供试品的制备

精密称取1g干燥的香柏干粉，置于50ml圆底烧瓶中，加60%的乙醇溶液回流提取50min，用布氏漏斗抽滤，旋转蒸发仪蒸干作为供试品，精密称重。

2.3 最大吸收峰的选择

精密吸取槲皮苷标准液3ml，加入无水乙醇9ml，振摇溶解，置于50ml容量瓶中，静置5min，再加入5%的 NaNO2溶液2ml，振摇，静置6min，加入10%的AI(NO3)3溶液2ml，振摇，静置6min，最后加入5%的NaOH溶液20ml，振摇，静置15min，用无水乙醇定容至刻度，以没加入槲皮苷且按照上述相同方法配制的乙醇溶液为空白溶液。在200nm～700nm的波长范围内扫描，结果槲皮苷在270nm，355nm，505nm处均有最大吸收，空白溶液无干扰。

精密称取供试品浸膏2mg，加入无水乙醇10ml溶解，按上述方法操作。在255nm，325nm，500nm处均有较大吸收。精密称取供试品浸膏2mg，加入无水乙醇10ml溶解，不加NaNO2-Al(NO3)3。NaOH显色，定容至50ml，在200nm～700nm的波长范围内扫描，结果在220nm～400nm处有吸收，而在500nm左右没有吸收，因此选用 500nm作为检测波长。

2.4 标准曲线的制备

分别精密量取1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml的槲皮苷标准品(0.35mg/ml)储备溶液，按照2.3 项下的操作方法进行操作。以第一瓶为空白液，在500nm波长处测定吸光度A值，以A值(y)为横坐标、槲皮苷的含量(x，mg/ml)为纵坐标作线性回归，得标准曲线：Y=12.923x-0.0048，r=0.9994。结果表明槲皮苷浓度在 0.017mg/ml一0.040mg/ml之问呈线性关系，满足含量测定要求。

2.5 供试品显色稳定性实验

将2．2项下制备的供试品，按2.3项下的显色方法进行显色，在500nm波长下每隔5min测定其吸光度。

实验结果表明，供试品溶液在30min内显色稳定，满足含量测定要求。

2.6 重复性实验

精密称取1g干燥的香柏干粉，共5份，分别置于50ml圆底烧瓶中，加60%的乙醇溶液回流提取50min，用布氏漏斗抽滤后，旋转蒸发仪蒸干，50℃下真空干燥至恒重，称所得浸膏总重，然后从该总浸中精密称取供试品浸膏约2.00mg，加入无水乙醇10ml溶解，按2.3项下的方法操作，在500nm处测定吸光度。然后计算生药中总黄酮的含量。5份生药样品中黄酮含量的RSD为0.92%。实验结果表明，香柏中总黄酮的含量测定方法重现性好。

2.7 精密度实验

取2.5项下的同1份溶液按相同的方法在500nm波长下，测定5次吸光度值，其精密度的RSD为1.0%。试验结果表明该方法精密度满足含量测定要求。

2.8 加标回收实验

精密称1g干燥的香柏干粉，共5份，放入50ml圆底烧瓶中，将2.1项下配置的标准品溶液，量取10.00ml，放入100ml容量瓶中，定容至100ml，用移液管精密量取2.0ml分别加入前述圆底烧瓶中，(相当于加标准品0.07mg) 按2.2项下的方法制得供试品溶液，按2.4项下的显色方法显色，测定吸光度值。测得加标平均回收率为105.4%， RSD为0.25%。

3 讨论

槲皮苷是香柏中含量较多的一种黄酮类成分，其母核结构和吸收波长与芦丁基本一致，本实验采用NaNO2一AI(NO3)3-NaOH方法显色，显色稳定，方法重现性好，准确度满足含量测定要求。选用500nm吸收波长，能较好的排除其他非黄酮类成分的干扰，较准确的反应提取物中总黄酮的含量。用上述含量测定方法测定三批香柏样品的总黄酮含量，分别为：4.14%，4.15%，4.14%。因此，该方法可以作为香柏总黄酮含量的测定方法。

1.对中枢神经系统的作用

多项研究表明槲皮苷对中枢神经系统有抑制作用，从百合花中分离出槲皮苷进行动物实验，研究表明槲皮苷能延长戊巴比妥诱导的小鼠睡眠时间，具有一定的镇定催眠作用。

2.对心血管系统的作用

槲皮苷具有抗动脉粥硬化（AS）的作用，研究证实oxLDL是诱发动脉粥样硬化的关键因素。最新研究表明槲皮苷能显著降低高脂血症大鼠的TC、TG、LDL-C水平，明显升高HDL-C水平，对家兔离体主动脉环具有舒张作用，且其舒张作用为非内皮依赖性，具有潜在调血脂、降血压作用。

3.抗氧化作用

槲皮苷具有清除多种活性氧自由基的能力，能抑制促氧化性药物诱导的TBARS产生，且对不同的促氧化性药物的抑制作用亦有所差异。

4.抗肿瘤作用

槲皮苷能抑制TPA诱导的肿瘤转化，下调UVB或TPA诱导的AP-1和NF-kB转录激活。此外，槲皮苷还可以促进Nrf2激活和提高GST活性。

5.抗炎镇痛作用

槲皮苷具有一定的抗炎活性，主要表现为致炎性因子的抑制作用。

6.抗病毒作用

槲皮苷能显著抑制HSV2活性，能强烈抑制流感病毒A/W3/33的感染作用，在病毒感染的初级阶段即可通过间接与病毒因子反应来抑制病毒复制，且抗病毒作用强于奥司他韦。

7.此外，槲皮苷还有降血糖血脂、止血、防治基因突变性疾病的作用。

槲皮素及其糖苷常用的提取方法有浸渍法、碱提酸沉法、回流法和超声法等。

（1）浸渍法

浸渍法是最简单的提取方法，即选用一定量的溶剂，将被提取物浸渍一定时间，过滤除去滤渣，浓缩滤液即可。该方法耗时长且得率较低，故近年来很少用于化合物的提取，但在比较不同提取方法的优劣时可用作对照。王文清等以70%乙醇作为溶剂，分别采用超声提取30min，加热回流1h， 浸渍12h三种方法提取20g细梗胡枝子药材，得到槲皮素的含量分别为4. 89、5.39 和 4.71μg/g， 芦丁的含量分别为36.70、37.53和 34.68μg/g。结果显示，采用加热回流法提取槲皮素和芦丁的提取率均较高，浸渍法提取率最低。

（2）碱提酸沉法

碱提酸沉法是提取植物中槲皮素及其糖苷的传统方法之一，该方法主要是利用黄酮苷类化合物易溶于碱性水溶液，难溶于酸性水溶液的性质。赵希等提取槐米中芦丁和槲皮素时，20g的槐米粗粉加入0.4%的硼酸水溶液200ml，用石灰乳调节pH值8~9。在微沸条件下搅拌提取30min，将滤液用浓盐酸调节pH值2~3，静置12h后离心处理，沉淀用pH值1~2的浓盐酸洗涤一次， 蒸馏水洗涤至中性，沉淀物经65℃真空干燥得到芦丁粗品。精制芦丁后取1g，用2%的H2SO4溶液80ml，加热回流90 min转化得到槲皮素。

（3）回流法

回流法也是提取槲皮素及其糖苷常用的方法之一，通常是将药材加入到一定溶剂中进行回流，采用正交试验法考察提取时间、溶剂用量和浓度等因素的影响。吴杰等分别用回流法与浸渍法提取仙人掌中的槲皮素，结果得到提取物中槲皮素的含量分别0.2423、0.2018 mg/g，可见回流法的提取率比浸渍法更高。该研究还用正交试验法考察了溶剂、溶剂浓度、回流时间、仙人掌粉末粒度四个因素对提取效率的影响，确定最佳回流提取条件为过60目筛的干燥仙人掌粉末10g，加95%甲醇 200ml，回流3 h。用回流法提取槲皮素及其糖苷操作简单，提取率高，存在溶剂有毒以及加热时易发生危险等缺点。

（4）超声提取法

近年来，超声提取法得到了广泛的应用，它具有时间短、得率高、安全、可靠、无毒等优点。吴景林以不同提取试剂分别用回流法和超声提取两种方式提取鱼腥草中的槲皮素，并对提取率进行了比较。结果表明，超声提取的提取率稍低于回流提取，差异不显著，但超声提取更简捷、快速。因此，考虑到经济性，超声提取法优于回流提取。