石房蛤毒素

更新时间:2021-10-27 21:33

石房蛤毒素(Saxitoxin,STX),已知毒性最强的海洋生物毒素之一,为贝类神经麻痹中毒(Paralytic shellfish poison,PSP)的主要毒素之一,由于是在美国阿拉斯加石房蛤和加州贻贝中发现的浓度最高且首先确定的PSP成分,故得名。后来又从膝沟藻(gonyaulax catenella)中分离出类似的新海藻毒素(Neosaxitoxin,neo-STX)及膝内藻毒素I-Ⅶ(gonyautoxin I-Ⅶ),其化学结构均与STX类似。已证实是赤潮的主要毒素之一。1977年合成了STX消旋体。

物化性质

化学结构及性质

STX的化学研究是在1960-1970年间利用链膝沟藻培养藻体得到标准品进行的,化学结构于1975年由Schantz等正式确定,分子式为C10H17N7O4,分子量为299.286。STX属海洋胍胺类毒素,是四氢嘌呤的一个衍生物,是络合有机物的四氢嘌呤衍生物,分子式中氮和氧的原子总数超过碳原子数,7个氮原子中有6个以两个胍基形式存在。活性部位主要在2个胍胺基和2个羟基。以STX为基本骨架,取代基不同而衍生出来的多种甲氨酯酸类生物碱化合物的混合体。

STX是一类低分子量二代盐神经性毒素,外观呈非结晶白色粉末,纯品是一种白色、吸湿性很强的固体,易溶于水,微溶于甲醇和乙醇,不溶于非极性溶剂,耐热,胃肠道易吸收,不被人体消化酶破坏,在高温和酸性条件溶液中稳定,酸性条件-20℃可保存数年不失活,只有在高浓度酸溶液中才发生氨甲酰酯水解,氧气也影响其活性。其在碱性条件下不稳定,可发生氧化反应,毒性消失,较高pH下迅速失活并产生荧光物质,利用这一性质可进行色谱分析。STX有2个滴定基,pKa分别是8.2和11.5,它们之间很容易相互转化,即毒性低的可转化为毒性高的。氧气也会影响其稳定性,使活性降低。由于STX耐高温和酸性环境,所以通常的烹调加工不能使其破坏,这一点对食品卫生与安全威胁最大。

分离纯化

STX等毒素的分离过程与河鲀毒素的分离过程基本相同。1975年Schanta等首先从加州贻贝中分离提纯STX,中国对于贝类的研究工作较迟,林燕堂、邱德全等分别对大鹏湾海域、广东沿海麻痹性贝毒及海南三亚海区的腹泻性贝毒有过研究报道。而试剂公司出售的标准品,是通过提纯原生藻类而得到的。蛤的毒素含量远低贻贝,但有毒蛤比贻贝容易获得,因而是毒素的主要来源。在蛤中大约有2/3的毒素存在于呼吸器官,在蛤呼吸器官中毒素含量为5000-10000Mu/100g或更多一点时才收集(Mu是小白鼠单位,用1.0mL含有毒素的水溶液注射到小白鼠的腹腔,一只体重20g的小白鼠如在10min后死亡称为1Mu),贻贝肝或消化腺的毒素要在0.5Mu/mg或多一点时才收集。

实验表明,多数弱碱性毒素能够吸附在Sephadexg-15或Bio-Gel p-2凝胶上,并可以用稀醋酸溶液进行洗脱。虽然弱碱性毒素在特殊凝胶上的选择性吸附还没有确切的理论,但这一发现却为提纯弱碱性毒素开辟了道路。用羧酸型树脂Bio-Rex70已经分离纯化出10多种STX及其衍生物。一般提取工艺如下:毒性贝或甲藻提取物→脱脂处理→Bio-Gel P-2(pH5.8)→水洗脱→Bio-Gel P-2-N-硫酸盐GTX(0.03mol/L醋酸洗脱代替水洗脱→粗毒素混合物→Bio-Rex70(H+)→梯度酸洗脱-STX,gTX,neo-STX)。弱碱性毒素经粗分离后,用羧酸型树脂Bio-Rex70的中压层析进行精分离,以梯度醋酸洗脱缓冲溶液而得到纯化的STX等毒素。其毒性为100-500Mu/mg。经过一次纯化,可得到2500Mu/mg或多一点的毒素,然后用Al2O3柱层析,纯化得5000Mu/mg的毒素,最后纯化可回收15%-30%的毒素,如果把较不纯的部分再进行纯化,回收率可增至50 %。

中国也开始了PSP毒素提取分离纯化研究,通过多柱多级分离纯化分级制备。通过培养塔玛亚历山大藻细胞,提取出PSP粗毒素,利用凝胶过滤和离子交换树脂分离纯化,最终得到-GTX2,3和GTX1,4纯品。对膝沟藻毒素制备及其测定方法进行了研究,但是中国未见STX分离纯化报道。已分离到20种以上的化合物,它们对研究钠通道作用机制及STX应用具有重要作用。

毒理

毒素分布

STX最初来源于某些有毒海洋藻类,主要是甲藻属的一些藻类,包括链膝沟藻、塔驼原膝沟藻、亚历山大藻、微小亚历山大藻等。某些淡水藻类也可以产生STX,如淡水蓝藻,某些细菌和红藻中也产生这类毒素,但尚未最后确证。已确定的产毒最高的物种是沟鞭藻类,是赤潮的致病微生物。此外,在淡水和海水河鲀鱼、两栖类动物(斑蟾)、红藻类和从甲藻细胞中分离出来的细菌。这些藻类产生的毒素,通过食物链蓄积于滤食性贝类、鱼、虾、蟹等水产品中,如贻贝、石房蛤、扇贝、鲭鱼、花纹爱洁蟹等。不同有毒藻所产生的毒素种类和含量不同,而同一种有毒藻产生的毒素种类和含量在生物不同生长阶段也不同,同时毒素产生状况还受到生物因素(如细菌)和非生物因素(如光照、温度、营养盐等)影响。并且毒素可以向更高一级的捕食者传递。通过生物富集水生食物链,传给陆地生物群,最后到人类。

世界各地都有包括石房蛤毒素在内的麻痹性贝类毒素分布,尤其是欧洲及北美一些国家。在世界各地水体中检测到毒素及中毒报道较多,中国东南沿海一带地区也经常发生食用有毒蛤类、螺类、贝类引发人中毒事件。STX通过非传统的(非滤食性生物)载体而引起人中毒已经得到证实,包括腹足动物、食肉动物、草食动物、甲壳类、鱼类等,监控和管理这些非传统载体,防止STX中毒具有重大意义。

毒性

石房蛤毒素的毒性包括神经系统、心血管系统和细胞毒活性3 个方面。STX是毒性最强的神经毒素之一,是典型的钠离子通道阻滞剂,通过阻滞Na+通过膜进入细胞内,使膜失去极化状态,从而阻断神经肌肉的传导。STX及天然衍生物所构成的PSP有很高的致死率,STX对成年人轻度中毒量为110μg,致死剂量为540-1000μg,STX和neoSTX毒性最高,LD50为9μg/kg(小鼠),其毒性是氰化钠的1000倍以上,是眼镜蛇毒性的80 倍。然而,由于每种衍生物对电压门控Na+通道受体具有不同的亲和力,因此这类毒素的毒性也不同,其中neoSTX的毒性仅次于STX。

中国已将STX毒素列为贝类产品常规检测指标之一。STX对呼吸和心血管功能均有抑制作用,对呼吸和心率抑制快速而持久,对血压抑制轻,作用时间短;STX可通过血脑屏障到达肝、肾和中枢神经;10μg/kg(ip)导致小鼠呼吸停止,心脏血管功能损害是致命的,毒素在小鼠体内不能代谢。

STX主要作用于突触前膜,与膜表面毒素受体结合,阻断突触后膜的Na+通道,产生持续性去极化作用,特异性的干扰神经肌肉的传导过程使随意肌松弛麻痹,导致一系列的中毒症状。STX在很低的浓度下(3×10-7mol/L)即可阻断Na+通道,而对K+通道则毫无影响。STX不影响突触前神经末梢传导介质的释放。STX对胆碱酯酶有抑制作用,对Na+、Ca2+、K+通道均有调控作用,已经成为寻找防治心血管疾病药物的重要来源。PSP类毒素具有钠离子通道阻断剂特性,可拮抗箭毒、藜芦碱的作用,以减少或“解救”细胞形态的改变及细胞裂解死亡,而且此拮抗或“解救”作用与PSP类毒素的量呈剂量-反应关系,根据此原理可以应用细胞毒性试验检测石房蛤毒素等麻痹性贝毒素。

毒素作用机理

STX毒素属于胍类毒素,其活性部位为7、8、9位的胍基,与可兴奋细胞膜上的电压门控Na+通道位点1的氨基酸残基高亲和,通过选择性阻断Na+内流,阻碍动作电位的形成而起抑制作用。由于神经Na+通道、脑Na+通道、心Na+通道、骨骼肌Na+通道等各种Na+存在差别,STX的7、8、9 位的胍基与Na+通道氨基酸残基的结合也有所不同,但都是与更靠近Na+通道外口的氨基酸残基结合。在成年兔骨骼肌Na+通道中,STX通过7、8、9位的胍基与通道上的Asp400和Glu755高亲和;此外,STX的C-12位的羟基(作为水合酮)和氨甲酰基侧链官能团对通道阻断也起一定作用,但不是关键性作用;STX1、2、3位的胍基与通道上的Asp1532亲和,也增加了其对Na+通道的阻断作用;而neoSTX在N1位比STX多了一个羟基,该羟基能够与Asp400和Tyr401作用,可与Tyr401形成氢键,因此比STX有更高的亲和力。

STX可阻断可兴奋细胞电压依赖性门控通道,对钠离子通道具有高亲和性。由于心房肌和心室肌属于快反应细胞,其特点是细胞的兴奋由钠离子快速内流引起。在STX的作用下,钠通道被阻断,心房和心室肌收缩因此下降。心房和心室肌对STX的敏感性有所不同。心房肌的敏感性较心室肌对STX的敏感性要低,在能完全阻断心室肌的STX剂量,心房肌节律虽有所减慢,但仍能维持,表明心房肌和心室肌钠通道的类型可能有所不同。心室收缩能力下降并不是心肌本身的收缩特性受到影响,因为在心室收缩完全阻断的情况下,心肌条仍可对2倍阈强度的电刺激起反应,这表明心脏传导阻滞主要发生在心房与心室之间的传导组织,其次在心肌细胞之间。研究表明STX仅作用于钠通道的外表面,但并不改变通道的门控行为。由于在STX作用下,心脏传导随剂量增加逐渐阻断,参与兴奋与收缩反应的肌纤维逐渐减少,故心肌收缩不断减弱,但心肌降至一定幅度时不再下降,因为与电极接触的那部分心室肌纤维直接接受外界电刺激发生兴奋和收缩反应,故心肌条收缩幅度不再发生变化。由于在STX作用下,心脏传导被阻断,外周血压因失去原动力而下降,这可能是外周血压下降的主要原因。由于STX与Na+通道受体具有很高的亲和力和特异性,因此,在低毒素浓度下(3×10-7mol/L),即可与Na+通道受体结合,进而产生高毒性作用。宋蔚忠等报道了STX对大鼠心血管和呼吸功能的影响,结果表明:STX对呼吸功能和心血管功能均起抑制作用,并且作用迅速,很快就能达到高峰,其中对呼吸和心率抑制快速而持久,对血压抑制轻,作用时间短。石房蛤毒素的外周降压作用,结果表明:0.4Mu/kg STX即对鳗鱼外周血压有明显的降低作用。对STX毒理进行了探讨,用猫做实验动物,静脉注射剂量10μg/kg,出现血压下降,心肌衰竭,心脏停搏等症状,证明STX可通过血脑屏障,到达肝、肾和中枢神经。

STX是重要神经毒素、Na+离子通道阻断剂,也是大多应激细胞去极化和转导关键因素,它还是其他受体蛋白如钙离子、钾离子通道,是转铁家族成员之一。STX作用机理与河鲀毒素(Tetrodotoxin,TTX)基本相同,但化学结构不同,可能不是作用于同一受体。STX通过与神经及肌膜上钠离子通道蛋白上的受体结合,结合部位是位点Ⅰ,主要作用于突触前膜,与膜表面毒素受体结合,该受体位于可兴奋细胞膜外侧表面,钠通道外口附近。毒素与受体结合后,阻滞Na+内流,不能引起膜去极化和动作电位的产生,产生持续性去极化作用,从而阻断离子通道,阻滞神经冲动的传导和肌肉收缩所需的动作电位传播,特异性干扰神经肌肉传导过程,使随意肌松弛麻痹,进而导致一系列中毒症状。STX与Na+通道结合具有高度的亲和力,在很低的浓度下(3×10-7mol/L)即可阻断Na+通道,因此表现出高毒性,而对K+通道则毫无影响。STX不影响突触前神经末梢传导介质释放。各衍生物的毒性大小与其结合Na+离子通道位点Ⅰ的牢固程度密切相关。一直以来,STX以其与其药理学受体的高亲和性和选择性而著称,而且一直认为电压开启Na+通道是其唯一作用通道。然而,研究发现,STX是一种多受体靶位的海洋生物毒素,除了Na+通道外,STX也结合Ca2+、K+通道,烟胺比林一氧化氮合成酶,STX代谢酶和2种循环流蛋白,即一种运铁蛋白和一种独特的血流蛋白。Sapse AM等研究表明,Na+通道被STX抑制的原因是从通道外膜胍基和羧基相互作用而不能结合Na+离子。此外,STX的C-12位的羟基和氨甲酰基侧链官能团对通道阻断也起一定作用,但不是关键性作用;STX1位胍基与通道上Asp1532亲和,也增加了其对Na+通道的阻断作用;而neo-STX在N1位比STX多了一个羟基,该羟基能与Asp400和Tyr401作用,可与Tyr401形成氢键,因此比STX有更高的亲和力。

检测方法

在食品卫生和安全方面,随着海洋环境的恶化,赤潮的大量发生,世界对贝毒的检验更加重视。美国从1925年就建立了贝毒监测制度,1958年以后,贝产地STX允许量为80μg/100g(相当于400Mu/100g)。日本、加拿大等都有类似的规定。饮水中的STX及类似物含量健康警戒线为3μg/L。

生物检测法

1、生物毒性试验法。小鼠生物法是AOAC推广的检测麻痹性贝类毒素的标准方法,是国际上都能接受的唯一的方法。该方法在检测样本总毒性方面相当成功,但是无法准确定性样本中单个毒素。此外,还有家蝇生物分析法、蝗虫生物分析法。上述3种生物分析技术原理相似。

2、细胞毒性试验法。石房蛤毒素具有Na+通道阻滞剂的特性,可拮抗箭毒、藜芦碱的作用,以减少或“解救”细胞形态的改变及细胞裂解死亡,且该拮抗或“解救”作用与毒素的量呈对应关系。根据该对应关系可以计算出毒素的含量。早期建立的方法是用显微镜计数活细胞数以检测PSP毒素的量,但试验时间长,操作繁琐,所需细胞量大。在该原理之上发展起来一种STX的快速诊断装置MIST,已成功用于酸性粗毒中PSP总毒性的测定及STX、neoSTX、GTX和dcSTX相关毒性的测定,该装置的灵敏度高,检测迅速且无需组织培养的设备及专业知识。

3、免疫分析技术。随着抗STX抗体的获得,免疫分析技术如血球凝聚反应、放射免疫分析(RIA)和酶联免疫分析(ELISA)等逐渐发展起来,其中直接竞争ELISA法是最常用的一种方法,检测限可达3pg/mL,间接ELISA的检测限也可达到10pg/mL。免疫方法灵敏度高,方便迅速,但抗体的获得是其关键,各毒素的交叉反应低,不能完全体现样品的毒性来源。

4、受体分析法。即固相受体结合法,主要是根据PSP毒素能与Na+通道蛋白质结合的特点,应用同位素标记以检测PSP类毒素的量,具有快速、可靠、准确的特点。以一种特异结合STX的类似转铁蛋白Saxiphilin代替Na+通道蛋白质,其对STX的鉴定具有专一性,从而与TTX的鉴定相区别。

仪器测定法

1、HPLC法及其联用技术。HPLC 法灵敏度高,专一性强,检出限量低,分析时间短,能够提供更多的毒素信息,是毒素检测的主要手段。但石房蛤毒素分子本身的生色基团很微弱,不易被检测,因而检测前要将其氧化成荧光生色团,用荧光检测器进行检测。氧化手段主要有柱前氧化和柱后氧化,柱后氧化在分离柱后另加的一个柱上进行,简化了操作步骤。随着质谱技术的发展,液质联用技术成为物质鉴定的一个强有力手段。

2、薄层色谱法(TLC)。TLC法是检测PSP毒素的传统方法之一,使用已较少。但新的检测设备的出现为其发展提供了新的空间。I在层析柱上对STX及其同系物进行棒状薄层层析分离,以火焰热离子检测器(FTID)进行检测,结果STX的检出限为5ng,其余同系物的检出限也均达到ng级。另外,气相色谱、离子交换柱层析、电泳法等均是检测STX毒素的传统技术,方法优劣各异。

生物检测法

小鼠生物测定法(mouse bioassay,MBA)是在STX得到鉴定之前就已经研究出来的检测方法,并且其它的检测方法都以该方法作为参照。MBA用于检测STX已经有很长的历史,是AOAC于1958年确认的法定检测方法。大部分国家依然在使用该方法。该方法技术上简单易行且不需特殊设备。鼠类的神经细胞对STX的反应与人类神经细胞的反应一样,因此,该方法的测定结果直接关系到人类健康的风险评估。多数国家规定海洋贝类产品中STX可接受的最大含量为80μg STXeq/100g,墨西哥控制在30μg STXeq/100g,菲律宾控制在40μg STX eq/100g。但也有人认为80μg STXeq/100g的检测限可以保证人类的健康不受威胁。这类毒素在饮用水中的含量规定也不同。1999年研究人员等通过实验计算出了饮用水中PSTs可接受的最大含量为3μg STXeq/L。后来,澳大利亚将这个浓度应用到了饮用水标准中,巴西将其定为强制性的法规标准,新西兰将这个浓度定为饮用水中可接受的最大含量。但是,MBA对该浓度的敏感度不够,样品不经过浓缩很难检测出来。MBA的最低检测限为40μg STXeq/100g,相当于0.2μg/mLSTX,或200μg/L STX。因此,尽管MBA一直被广泛应用于检测经生物富集作用而STX含量高的海产品中,却不适用于饮用水中STX含量的检测,同时无法准确定性样本中单个毒素,而且实验动物检测方法在某些地区已经被禁止。针对存在的这些问题,逐渐研究出一些新的检测贝毒的方法,如化学、生物化学、毒性测定等方法,同时也可用于检测淡水蓝藻和被污染的水源。

运用细胞生物测定法来检测PSTs含量的方法已经建立,并且可以代替MBA进行毒性检测,该方法专门用于检测像STX这类可以阻断电压门控Na+通道的毒素。神经瘤细胞测定是在神经细胞内的Na+通道水平上检测PSTs。STX是一种Na+通道阻断剂,其功能是可以通过与打开钠通道的藜芦定的拮抗作用检测出来。最初建立的细胞生物测定法是通过鼠神经母细胞瘤的形态学作为端点来评估测定结果,随后对这种方法进行了改进,采用色度法显示有更好的选择性。因此,如果实验室能承担得起基于MS的检测方法的仪器费用,那么这种检测方法在将来很可能会代替STX的色谱分析。

受体结合测定法

通过末点来测定细胞的活力,从而使其更便于自动控制。在这种测定方法中,神经瘤细胞培养于96孔细胞培养板中,用Na+通道激活剂藜芦定处理,增强Na+以及Na+/K+-ATP酶抑制剂乌本甙的内流,从而阻断Na+外流。在PSTs的存在下,通过使用MTT【3-(4,5-二苯基-2-羟基)-2,5-二苯基四唑】来测定细胞活力。通过使用标准量的藜芦定和乌本甙,细胞受保护的程度可以通过与PSTs的标准量对比,以此来定量PSTs的总量,然后结果转换成STX当量。鼠和人的成神经瘤细胞都可以用于该测定方法。

Saxiphilin是一种结构与转铁蛋白相似的蛋白,研究表明,其与PSTs有很高的亲和力。然而,不同的Saxiphilin对不同的类似物有不同的亲和力。到为止,从热带蜈蚣(Ethmostigmus rubripes)体内分离的Saxiphilin在试验中有最小的选择性。利用这一特性,Llewellyn LE等建立了检测PSTs的特异受体法,该方法的检测限为6.3μg STXeq/L或1.3μg STXeq/100g贝肉。但研究人员声明,在没有额外的基质干扰下,如果增大样本容量,该方法的检测限会降低。从热带蜈蚣体内提取粗Saxiphilin的程序很简单,制备的产物很稳定,可以反复冻融,在-80℃下可以保存一年以上。编码Saxiphilin蛋白的基因克隆,以及文库的构建已经完成,可以通过真核表达系统表达该蛋白,并且得到的表达产物具有生物活性。更进一步的研究证明,同时采用SCBA 和Saxiphilin受体检测法检测介虫和贝类体内的非PSTs钠离子通道活性,其实用性很好,因为非PSTs如河鲀毒素(TTX)不与Saxiphilin结合,而且检测结果与HPLC和MBA的结果有很好的相关性。

该方法最初是用来监测贝类和鱼类产品中的海洋毒素,并且在检测海洋神经毒素类方面得到了很好的验证。其他的研究人员也运用此法检测在淡水蓝藻细菌中占优势的PSTs的衍生物,进一步对该法进行了的验证。研究表明,神经细胞瘤生物测定法得出的结果与鼠生物法测定的结果很接近(相关系数R2=0.96),而且有敏感性更高的的优点,其检测限为10ng STXeq/mL提取物(相当于2.0μg STXeq/100g 贝肉)。通过细胞生物测定法获得的结果与色谱法得到的结果也有很好的相关性。然而,生物测定法有其独特的优点,即对任何可以抑制Na+通道的毒素,无论是已知的PSTs类似物,还是未知的变异体,都有很好的敏感性。该测定方法可以检测未定性的、不能被色谱法检测出来的很多毒素。细胞生物测定法不能区分相似的毒素,只能提供一个所有毒素的累积效应值,因此与MBA相比,在细胞培养测定中该方法很难确定相关毒素类似物的毒性反应,除非将每个类似物进行单个的分析。然而,当使用复杂的PSTs混合物时,细胞生物测定法与MBA相比是一个很好的毒性预测器。还同时使用MBA、细胞培养测定、HPLC和放射性受体测定对含有复杂的PSTs的21种贝肉提取物进行了分析,在这四种检测技术中,与MBA相关的细胞培养测定法的测定结果与预期的毒性最接近。但是,细胞生物测定法依然存在一些缺点。首先,由于该方法依赖藜芦定和乌本甙的拮抗作用,必须使用适当的浓聚物以使其与PSTs反应敏感。任何毒素浓聚物浓度的改变都会降低该方法对PSTs检测的敏感性。其次,该方法的标准检测装置运行慢,需要很长的细胞孵育时间(24-48 h),才能对成神经瘤细胞形成细胞毒性作用。

化学仪器分析法

HPLC被广泛用于有机化合物的分离,同时也是第一种用于检测PSTs的仪器分析方法。然而,该技术也存在一些缺点,首先需要毒素标准品作参照,其次缺少用来制备荧光产物的光反应酶或后置柱衍生物化法的载色体,尤其是在样品制备过程中PSTs可能会发生化学转化。这种转化经常会使低毒的毒素变成毒性强的毒素,导致无法确定原始样品中毒素的真实毒性。因此,毒素的变异促使检测方法也不断发展,促进更精确的抽提和分离方法的发展。最早的STX理化检测方法是由Bates和Rapoport提出的,由于缺乏STX的载色体,这种方法只能在碱性环境下,将STX用过氧化氢氧化成荧光化合物以达到检测的目的。那时,人们认为这种方法的敏感度比鼠生物法的要高,并且建议用这种方法来进行贝类样品的常规检测。然而,这种方法操作很复杂,使用好几种溶剂和10步以上的化学过程。他们对这种方法进行了改进,增加了精确度和可重复性,但这种方法的操作依然很复杂。

在20世纪80年代,许多研究机构使用诸如X射线衍射、薄层色谱-荧光检测、高速液相色谱(HSLC)等方法发现了新的化合物。1975年,Shimizu等第一次描述了gTX1、GTX2、和gTX3的存在。使用葡聚糖凝胶g或生物胶P-2聚丙烯酰胺凝胶柱,通过稀乙酸洗脱,从gTX成分里分离出了STX,然后使用HSLC将gTX的峰值分解成三种不同的毒素。1987年,Oshima和他的合作者开发了一种后置柱氧化法,该方法可以详细地分析天然甲藻、水华、贻贝、牡蛎等抽提物中所含的PSTs。与Oshima的后置柱氧化法相反,Lawrence等研制了使用前置柱氧化的液相色谱法,来产生带荧光的PSTs衍生物。他们证明,使用过氧化氢氧化对分析非羟基化毒素的敏感性更强,而高碘酸盐氧化作用对分析羟基化毒素的敏感性更强。在这一时期,他们改进了这种技术,例如向高碘酸盐氧化剂中添加了铵甲酸盐,从而改善了neoSTX、GTX1、B2和C3的分析结果,而且由于添加了这种化合物到流动相,使neoSTX和B2的色谱分析更好。由于在检测过程中,pH对检测结果的影响很大,研究人员在检测过程中对pH进行了控制。Gago-Martinez等使用前置柱方法时,分别将高碘酸盐和过氧化物氧化过程的pH调节到7.2-12和8.2-12.8,最后得到的荧光氧化产物的产量不同。当pH在8.2时,通过高碘酸盐氧化作用neoSTX的产量达到了最大,而pH在10-11.5时,STX、GTX2/3、dcSTX和gTX5的产量也都达到了最大。Lawrence等声明采用柱前氧化pH很容易控制,因此结果的可重复性更强,因为在后置柱氧化时pH变化很小,相应对标记上荧光的产物的产量影响很小。然而,尽管柱前方法相对比较简单,但是一些PSTs形成了相同的氧化产物,另外一些形成了不只一种荧光产物。这种方法被建议作为一种筛选方法来为监测程序服务。最初的提议是首先使用高碘酸盐氧化方法,当检测出大多数PSTs,并且毒素浓度超过常规检测限80μg STXeq/100g时,接着采用过氧化氢氧化。色谱氧化法已经用于检测贝类中的毒素,研究PSTs在不同地区鼠脑的分布,他们认为这种方法很合适,敏感度也很高,因此该方法已被欧洲国家确定为检测PSTs的官方检测方法之一。然而,Ben-Gigirey等进行了实验室研究,推断尽管该方法适合于检测研究,但对含有更复杂毒素的样品进行分析时,得到的结果不理想,并且也不是对所有的PSTs都有效。此外,该法只是针对STX、GTX2/3、dcSTX、dcGTX2/3等毒素类似物,可以得到满意的检测结果。Turner等使用该标准对Lawrence的方法进行了进一步的验证,主要包括其选择性、线性、检测限、准确性、回收率、精确度、可重复性、适用性,同时也包括添加dcNeoSTX、dcGTX2/3等PSTs。对该方法进行了改进,以增加氧化产物的稳定性,改善了固相离子交换的纯度,最终推断该方法可以得到满意的结果。

液相色谱-质谱联用法(Liquid chromatography–mass spectrometry,LC-MS)是一种有效的检测技术,可以用来鉴定未知的化合物,定量已知的物质,阐明新分子的化学性质和结构,实现检测的高敏感度、可选择性、精确定量和高通量。然而,LC-MS价格昂贵,需要有专业知识的技术人员操作和维护。尽管如此,Quilliam建议将LC-MS检测方法作为检测海洋毒素的普遍方法。MS检测PSTs面临的挑战之一是离子配对剂对目标化合物的离子化产生干扰,因此离子配对剂要对PSTs有高效的反相色谱。因此,研制了一种色谱方法,该方法使用基于非离子配对洗脱和后置柱电化学氧化的阴阳离子串联交换柱。开发了一种实用的亲水性液相色谱法,该方法不仅可以分离主要的PSTs,而且还可以分离蓝藻细菌中的甲醛类毒素、柱孢藻毒素等。采用该方法,在质谱仪运行选择性反应监控程序时,检测出了15种PSTs,并鉴定出了新的毒素类似物。使用两性离子亲水作用色谱法分别与MS和荧光检测联用,在单个梯度下来检测PSTs,他们推断这两种方法都可以得到可靠的定量结果,能够很好的分离更多相关的PSTs。这两种检测方法的检测限只有微小的不同,荧光检测仪有更好的敏感性,而MS检测仪在更短的运行时receptor-binding assay,RBA)、免疫学分析技术等。随着科学技术的发展,又出现了一些新的研究方法应用于检测STX及其类似物,例如生物传感器法、色谱-质谱连用法、荧光定量PCR等方法。

钠离子通道测定法

公布了一种快速、敏感度高的鼠脑钠离子通道方法。实验中分离了15-40个鼠脑用来制备钠离子通道含量为5.8±0.06 pmol/L的溶液,该溶液在-80℃条件下,至少可以保存30d。钠通道吸附在96孔培养板的板底,然后加入含有3H-STX的溶液,钠通道会与3H-STX结合。将未结合的3H-STX洗掉,并对结合上的毒素进行闪烁计数以定量。但研究人员发现,尽管用牛血清白蛋白(BSA)封闭板孔来阻止非特异性结合,但通过放射性检测依然有21%的非特异性结合。然而,尽管有相对较高的背景,使用未标记的和3H 标记的STX所做的竞争实验得到的IC50值为1.7ng STX/mL。用粗的含有PSTs混合物的贻贝提取物所做的实验显示,其结果与MBA和HPLC的结果有很好的相关性。根据其精确度判断,可以作为一种典型的检测方法,并且在几小时内就可以得出结果。改进了这一方法,使其实现了相对高通量的形式,而且采取更大样本容量的检测验证了这一点。制备的钠通道在-80℃条件下,可以稳定保存至少6个月。他们也提供了更宽泛的QA/QC标准,来解释测定结果。给出了一个竞争结合3H-STX和未标记STX的抑制常数(Ki)3.66 nmol/L,和样品提取物LOD 的估计值5 ng STX/mL。检测分析了26个贝类样本和20个浮游植物样本,证明该方法的测定结果与HPLC和MBA测定的STX毒性当量的摩尔数有着合理的相关性。钠离子通道结合测定方法(The sodium channel-bindingassay,SCBA)测定的浮游植物和贝类样品提取物的毒性,略高于HPLC和MBA的测定结果。对该方法进行了改良,从而使其在不同的实验室使用不同的闪烁计数器可以得到准确且精确的结果,并对仪器的操作程序进行了优化。SCBA也存在一些缺点,例如,该方法依赖放射性标记的STX和非标准化钠通道的制备,尤其是制备的钠通道的活性及其保存时间对检测产生很大的影响。

生物传感器检测法

有关生物传感器用于检测PSTs的报道很少。很多研究人员都试图通过将鼠脑Na+通道、抗PSTs的抗体或Saxiphilin蛋白吸附于表面等离激元检测芯片上建立生物传感器方法。该技术主要是检测与配体结合到一个固定在传感器芯片上的大分子相关的分子构象的改变。虽然该方法处于研究初期,却为检测方法的研究带来了新的希望,尤其是使用抗体作为传感分子来检测目标物。然而,检测限依然不足以检测饮用水中的PSTs。而且,当抗体用作传感分子时,相同的关于限制ELISA实用性的交叉反应问题也出现在了该技术中。用Na+通道做成的组织传感器在测定淡水藻类中的STX时非常敏感,用蛙气囊膜做成的生物传感器,可以测量非常微量的STX。

免疫学检测方法

由于ELISA方法具有敏感、快速、操作简便的优点,已经广泛用于检测中,尤其是医学和食品检测领域。该技术所面临的挑战是检测像PSTs这样的多种相关化合物的混合物时,需要保持其识别靶物质结构多样性的能力,同时忽略复杂的基质中其它化合物的影响,对此概述了建立抗体检测技术的研究进展。研究显示,抗STX的抗体与neoSTX有很弱的交叉反应,而且这种选择性可以应用于该家族的所有类似物。研究发现基于抗STX抗体和抗neoSTX抗体的测定之间有很弱的相关关系,结合这两种测定结果,检出率虽然得到了改善,但是依然不高,只有MBA的80-85%,阳性结果较低。Kawatsu等建立了针对gTX2/3的单克隆抗体,以完善先前建立的针对STX和neoSTX的抗体。该抗体保持着与STX/neoSTX家族其它抗体的差别,但是和gTX2/3、dcGTX2/3、C1/2有着很相似的亲和力。Garthwaite等对多重检测方法进行了深入的研究,并建议使用一整套的ELISA,不仅检测贝类样品中的PSTs,也检测遗忘性贝类毒素、腹泻性贝类毒素和神经毒性贝类毒素。荧光定量PCR法Al-Tebrineh J等建立了一种SYBRgreen的特殊定量PCR方法,来定量检测鱼腥藻属蓝藻细菌产生的STX。该方法主要是通过确定蓝藻细菌中已鉴定的STX基因簇中独特的多聚乙酰序列拷贝数来推断样品产毒性的能力。使用这种方法检测了从澳大利亚不同地方的湖泊、水库、河流中采集的水样,通过HPLC和显微细胞计数确定了水华中STX的富集和蓝藻细菌细胞密度。通过实验证实,STX富集确实与STX基因拷贝数相关,这就表示后者可以作为一种测量鱼腥藻属和其它水华蓝藻细菌的产毒潜能的方法。定量PCR 方法的靶向STX基因也可以用于水华鱼腥藻属和其它几种蓝藻细菌产STX的能力的监测和生态生理学研究。

临床表现及治疗

人类多因误食含STX的贝类等海产品而发生中毒,中毒症状往往因食入的量不同而不同。轻度中毒表现为恶心、呕吐、腹泻,局部皮肤有麻或刺痛感。重度中毒后,表现为神经肌肉麻痹,随意肌无力,呼吸肌收缩无力,血压下降,心率减慢,心律失常,患者多感到身体有漂浮感,严重中毒15min内就可死亡,STX中毒的死亡率约为10%左右。对STX中毒没有特效药,临床上主要是采取催吐、洗胃,用活性炭吸附胃内的毒素。4-氨基吡啶可以拮抗STX的毒性作用,起到治疗效果,但4-氨基吡啶毒副作用大,安全剂量范围小。因此,4-氨基吡啶对STX中毒的治疗效果和安全剂量范围有待进一步研究。

石房蛤毒素中毒死亡率高,无特异性解毒药,主要是对症支持治疗。中毒病人在常规治疗的基础上主要采用了以下三项措施(1)维持体内弱碱性内环境,依据血气检测结果,用5%碳酸氢钠溶液静脉滴注,维持血气pH7.40-7.45、HCO3-24-27mmol/L至患者出现表浅自主呼吸运动为止。(2)换血疗法,是中毒的重要治疗措施之一,能迅速降低血液毒素浓度,促进机体代谢,促进解毒,较安全。(3)中药汤剂灌服,中医认为动物毒中毒属邪毒,主要以清热解毒为治法,复《景岳全书》:“紫苏叶,味辛、气温……解鱼蟹毒,治蛇犬伤……”。用紫苏叶20g加生甘草10g煎至150ml经胃管灌服应有利于解毒。

应用

STX在赤潮检测、分子生物学、神经生物学、医学诊断、药物开发、军事战剂等研究中都有应用。在医学诊断与药物开发方面,STX独特的化学结构和毒理作用机制,在研究平滑肌和心肌离子流、Na+通道结构、化学药物对神经肌肉传导的影响等方面,使它成为研究Na+通道的重要工具药。PSP 的镇痛、麻醉、解痉、止喘以及作为抗癌药物方面已经开始探索。STX具有显著的抗肿瘤、抗病毒活性,对癌细胞的破坏性相当高。STX具有较强的降压作用,2.0-3.0μg/kg可降低狗和猫正常动脉血压的2/3,剂量大于1.5μg/kg时可能阻滞血管神经而减小外周阻力;剂量大于1.5μg/kg时则直接弛缓血管肌肉而达到降压目的。STX有局麻作用比普鲁卡因强10万倍。

STX长期以来为军事实验室所应用。据称,它不能与用于大量分布的神经毒剂相比,但作为一种毒弹装备较为有价值。用来福枪射出STX到人体,仅感觉与蚊子咬痛相仿,但不到15min即死亡,比细菌毒素引起的死亡时间短很多。STX是一种快速毒素,中毒后症状在0.25-4.00 h发作,STX是强烈的胆碱酯酶抑制剂,对中枢和外神经均有强烈的作用;它对中枢的作用主要是对心血管和呼吸中枢的作用,它能妨碍离子的通透,从而扰乱神经-肌肉的传导。

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