微生物产生硫化氢之发酵途径，主要有两种。

途径一：

硫化氢由培养基中蛋白质成份之半胱氨酸（cysteine）还原而产生。 蛋白质经微生物酵素分解，形成含硫之半胱氨酸，此氨基酸经半胱氨酸脱硫酵素（cysteine desulfurase）作用失去硫原子，而自水分子加入氢形成硫化氢。

途径二：

硫化氢由无机硫化合物如硫代硫酸盐（thiosulfate；S2O32-）、硫酸盐（sulfate；SO42-）或亚硫酸盐（sulfite；SO32-）等所产生，当培养基含硫代硫酸钠时，有些微生物可将其还原为亚硫酸盐，并释出硫化氢。

本实验使用SIM培养基，内含蛋白质与硫代硫酸钠作为硫受质，另含硫酸铵亚铁（ferrous ammonium sulfate；Fe(NH4)2SO4）作为硫化氢指示剂，（硫化氢为无色气体，不易察觉，硫酸铵亚铁之亚铁离子可与硫化氢反应生成不溶性硫化亚铁之黑色沉淀。）培养基含0.3﹪琼脂使成半固体，以增强厌氧呼吸，亦可观察微生物之运动性，如具运动性，则微生物生长沿接种线向四周扩散，使培养基呈混浊，如无运动力，则生长仅限于接种线。