在生物学研究中，科学家们常常利用这种能自己发光的荧光分子来作为生物体的标记。将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。生物学家一直利用这种标记方法，把原本透明的细胞或细胞器从黑暗的显微镜视场中“揪出来”。

传统的荧光分子在发光的同时，会产生具有毒性的氧自由基，导致被观察的细胞死亡，这叫做“光毒性”，因此，在绿荧光蛋白发现以前，科学家们只能通过荧光标记来研究死亡细胞静态结构，而绿荧光蛋白的光毒性非常弱，非常适合用于标记活细胞。

然而，绿荧光蛋白被发现20多年后，才有人将其应用在生物样品标记上。1993年，马丁·沙尔菲成功地通过基因重组的方法使得除水母以外的其他生物（如大肠杆菌等）也能产生绿荧光蛋白，这不仅证实了绿荧光蛋白与活体生物的相容性，还建立了利用绿荧光蛋白研究基因表达的基该方法，而许多现代重大疾病都与基因表达的异常有关。至此，生物医学研究的一场“绿色革命”揭开了序幕。

后来，美籍华人钱永健系统地研究了绿荧光蛋白的工作原理，并对它进行了大刀阔斧的化学改造，不但大大增强了它的发光效率，还发展出了红色、蓝色、黄色荧光蛋白，使得荧光蛋白真正成为了一个琳琅满目的工具箱，供生物学家们选用。生物实验室普遍使用的荧光蛋白，大部分是钱永健改造的变种。

有了这些荧光蛋白，科学家们就好像在细胞内装上了“摄像头”，得以实时监测各种病毒“为非作歹”的过程。通过沙尔菲的基因克隆思路，科学家们还培育出了荧光老鼠和荧光猪，由于沙尔菲与钱永健的突出贡献，他们与绿荧光蛋白的发现者下村修共享了2008年的诺贝尔化学奖。

瑞典皇家科学院将绿荧光蛋白的发现和改造与显微镜的发明相提并论，成为当代生物科学研究中最重要的工具之一。

GFP荧光极其稳定，在激发光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比荧光素（fluorescein）强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定。

GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。

GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析。但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。

由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。

1994年，华裔美国科学家钱永健（RogerYonchienTsien）开始改造GFP，有多项发现。世界上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种，有的荧光更强，有的黄色、蓝色，有的可激活、可变色。到一些不常用做研究模式的生物体内找有颜色的蛋白成为一些人的爱好，现象正如当年在嗜热生物中找到以后应用广泛的PCR用多聚酶后的一波浪潮。不过真发现的有用东西并不很多。成功的例子有俄国科学院生物有机化学研究所SergeyA.Lukyanov实验室从珊瑚里发现其他荧光蛋白，包括红色荧光蛋白。

生物发光现象，下村修和约翰森以前就有人研究。萤火虫发荧光，是由荧光酶（luciferase）作为酶催化底物分子荧光素（luciferin），有化学反应如氧化，以后产生荧光。而蛋白质本身发光，无需底物，起源是下村修和约翰森的研究。

下村修和约翰森用过几种实验动物，和本故事相关的是学名为Aequoreavictoria的水母。1962年，下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》上报道，他们分离纯化了水母中发光蛋白水母素。据说下村修用水母提取发光蛋白时，有天下班要回家了，他把产物倒进水池里，临出门前关灯后，依依不舍地回头看了一眼水池，结果见水池闪闪发光。因为水池也接受养鱼缸的水，他怀疑是鱼缸成分影响水母素，不久他就确定钙离子增强水母素发光。1963年，他们在《科学》杂志报道钙和水母素发光的关系。其后Ridgway和Ashley提出可以用水母素来检测钙浓度，创造了检测钙的新方法。钙离子是生物体内的重要信号分子，水母素成为第一个有空间分辨能力的钙检测方法，是仍用的方法之一。

1955年Davenport和Nicol发现水母可以发绿光，但不知其因。在1962年下村修和约翰森在那篇纯化水母素的文章中，有个注脚，说还发现了另一种蛋白，它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。其后他们仔细研究了其发光特性。1974年，他们纯化到了这个蛋白，当时称绿色蛋白、以后称绿荧光蛋白GFP。Morin和Hastings提出水母素和GFP之间可以发生能量转移。水母素在钙刺激下发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。这是物理化学中知道的荧光共振能量转移（FRET）在生物中的发现。

下村修本人对GFP的应用前景不感兴趣，也没有意识到应用的重要性。他离开普林斯顿到WoodsHole海洋研究所后，同事普腊石（DouglasPrasher）非常感兴趣发明生物示踪分子。1985年普腊石和日裔科学家SatoshiInouye独立根据蛋白质顺序拿到了水母素的基因（准确地说是cDNA）。1992年，普腊石拿到了GFP的基因。有了cDNA，一般生物学研究者就很好应用，比用蛋白质方便多了。

普腊石1992年发表GFP的cDNA后，不做科学研究了。他申请美国国家科学基金时，评审者说没有蛋白质发光的先例，就是他找到了，也没什么价值。一气之下，他离开学术界去麻省空军国民卫队基地，给农业部动植物服务部工作。当时他如果花几美元，就可以做一个一般研究生都能做，但是非常漂亮的工作：将水母的GFP基因放到其他生物体内，比如细菌里，看到荧光，就完全证明GFP本身可以发光，无需其它底物或者辅助分子。

将GFP表达到其它生物体这项工作，1994年由两个实验室独立进行：美国哥伦比亚大学做线虫的MartyChalfie实验室，和加州大学圣迭哥分校、Scripps海洋研究所的两位日裔科学家Inouye和Tsuji。

水母素和GFP都有重要的应用。但水母素仍是荧光酶的一种，它需要荧光素。而GFP蛋白质本身发光，在原理上有重大突破。

Chalfie的文章立即引起轰动，很多生物学研究者纷纷将GFP引入自己的系统。在一个新系统表达GFP就能在《自然》、《科学》上发表文章，其实不过是跟风性质，没有原创性。

纵观整个过程，从1961年到1974年，下村修和约翰森的研究遥遥领先，而很少人注意。如果其他生化学家愿意，他们也可以得到水母素和GFP，技术并不特别难。在1974年以后，特别是八十年代后，后继的工作，很多研究生都很容易做。其中例外是钱永健实验室发现变种出现新颜色，并非显而易见。

生物技术中的应用研究

1．分子标记

作为一种新型的报告基因，GFP已在生物学的许多研究领域得到应用。利用绿荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（proteintagging），即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能，利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导等。1996年，Ehrdardt等人首次报道了利用GFP的特性研究细胞分化蛋白FtsZ的定位。研究显示FtsZ在细胞分裂位点形成了一个环状物，且至少有9种蛋白在细胞分裂中起重要作用，尽管对这些蛋白功能仍然不是很清楚，但是利用GFP融合蛋白已经搞清楚了它们聚合的顺序以及在蛋白定位中的一些特征。利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察的新方法。

除用于特定蛋白的标记定位外，GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。Shi等人曾报道将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白，这一技术将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境检测以及探测信号转导过程等等。这些都为传统生物学研究提供了新思路和新方法，成为交叉学科研究的热点。

2．药物筛选

许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选，这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所感兴趣的药物。基于细胞的荧光分析可分为三类：即根据荧光的密度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究目标蛋白如受体、离子通道或酶的状态的变化。荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针。

在细胞体内分子之间的相互作用非常复杂，其中很多涉及到信号分子在细胞器之间的迁移。例如当信号分子和某一特殊受体结合后常会导致配体-受体复合物从某一细胞区域迁移到另一区域，而这一迁移过程通常会介导一重要的生理功能。因而，这些受体常常被用作药物筛选的目标，若某一药物具有与信号分子类似的功能，那么该药物即具有潜在的医药价值。利用GFP荧光探针，将很容易从数量众多的化合物中判断出哪些化合物具有与信号分子相似的能引起配体一受体复合物迁移并介导生理反应的功能，且这一筛选过程简单方便，所需成本也很低。利用这一原理，已经成功构建了一个筛选模型用于研究药物介导的糖皮质激素受体（hGR）的迁移过程。在一96孔板中培养细胞，并以一编码hGRGFP蛋白的质粒转染该细胞。当细胞用待筛选的药物处理后，hGR-GFP从细胞质迁移人细胞核的过程可实时或在某一时段内被证实，根据荧光分布即可推断哪一种药物具有与hGR配体相类似的功能。利用GFP来进行药物筛选由于受其必须与迁移的信号分子相偶联，其筛选容量相对较低，但是由于GFP在细胞内的穿透性强及独特的发光机制，因而在药物筛选中具有相当大的应用潜力。

3．融合抗体

近二十年来，抗体生成技术有了飞速发展，已经从细胞工程抗体（杂交瘤技术一单克隆抗体）发展到了第三代抗体：基因工程抗体，尤其是噬菌体抗体库技术的出现，解决了人源抗体的研制问题，促进了各种性能优良抗体以及具有多种功能的抗体融合蛋白的开发。单链抗体（Single-chainvariablefragment，ScFv）是研究得较多的一种小分子抗体，其优越性在于可在宿主细胞内大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白。关于绿荧光蛋白融合单链抗体的报道很多，国内也有相关报道，如程虹等报道将抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体并导人小鼠成纤维细胞NIH3T3表达并获得成功。因融合抗体具有与抗原结合及发射荧光两种特性，故这一人工分子可用做免疫染色的检测试剂，直接应用于流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤的检测等等。

由于技术上的的原因，一般融合抗体均置于原核表达系统如E.coli中表达。为便于表达蛋白的分离纯化，一般在单链抗体的N端或C端插入一6×His序列，便于用Ni-NTA亲和层析柱纯化目标蛋白。但这一技术也存在一些问题。由于抗体分子内存在二硫键，而在原核表达系统内由于抗体不能正确折叠，容易形成包涵体，表达出来的目标蛋白无活性，需要在氧化还原体系中进行复性。但也有报道在动物细胞细胞质中成功表达出具有抗原结合活性的单链抗体。若能成功解决融合抗体的表达问题，则在免疫染色及肿瘤检测这一领域融合抗体将扮演极为重要的角色。

4．生物传感器

蛋白质工程技术已经开始采用将一具有信号传导功能分子识别位点的分子结合到另一分子上来设计生物感受器。绿荧光蛋白由于其独特的光信号传导机制，以及在表达后易被周围化学环境和蛋白之间的相互作用所影响的特性，因而极适于用做活细胞体内的光学感受器。第一个基于GFP的生物感受器为Ca2+感受器，由Romoser和Miyawaki几乎同时提出。这一感受器原理是利用钙调蛋白结合钙离子后引起的空间构象变化导致两种GFP突变体间发生荧光共振能量转移。但是由于大多数蛋白不能像钙调蛋白那样承受较大的空间构象变化，为克服这一缺点，人们开始提出利用基因融合技术将一新的分子识别位点结合到GFP上以构建新的分子感受器。Doi和Yanagawa根据这一原理将TEM1β-内酰胺酶（Bla）融合到GFP上。当缺少目标分子时，GFP处于静止状态不会产生荧光。但是当目标分子β-内酰胺酶抑制蛋白（BLIP）与Bla结合后，即使GFP活化产生荧光，而这一变化很容易被检测到。将受体蛋白插入到GFP表面的技术已经成为构建分子感受器的有力工具，这种GFP感受器能被用来检测多种分子，如蛋白质、核酸、激素、药物、金属及其他的一些小分子化合物等，其潜在应用前景极为广阔。

肿瘤发病机制的应用

GFP是一个分子量较小的蛋白，易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能。GFP与目的基因融合，将目的基因标记为绿色，即可定量分析目的基因的表达水平，显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化，为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件。

在肿瘤的形成过程中，增殖和凋亡是一对相互矛盾的统一体。若肿瘤细胞凋亡占优势，肿瘤组织将长期处于休眠状态或自行消亡。肿瘤细胞的凋亡受凋亡相关基因调控。用GFP转染肿瘤细胞凋亡相关基因，并与正常组织进行比较，则大致可判断此基因为抑制肿瘤细胞凋亡的基因；反之，为促进肿瘤细胞凋亡的基因。

肿瘤细胞浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动和基质内增殖等一系列过程的表现，其根本原因在于肿瘤细胞内某些基因表达异常。利用GFP的示踪特性，研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系，即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制。

在信号转导中的应用

新近研究发现，某些突变的GFP能够发生荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）。FRET是一种从荧光分子的激发状态到临近基态接受分子之间量子力学能量转移的现象。FRET发生的前提条件是，荧光接受分子必须在荧光提供分子释放态所具有的波长范围内接受能量。如果供应分子和接受分子相互定位在几个纳米之内，则非常利于FRET的产生。因为FRET对于两个荧光分子相互间的定位和距离高度敏感（在纳米范围内）。两个分子间微小的线性或空间定位关系的破坏可以强烈地改变能量转移的效率。由于FRET能量转移并非是100%的效率，一个实用而有效的检测FRET的方法是，仅仅激发荧光供应分子，然后计算供应分子对于接受分子荧光释放的比率。比值的变化是一个理想的观测细胞动态变化的指标。因为它消除了GFP分子在绝对浓度、细胞的厚度、激发源的能量度以及检测的绝对效率等的影响。利用FRET可以作成GFP依赖的生物探针，现已有研究人员设计大分子或分子配对物来改变GFP之间原有生理信号反应的FRET。

研究发现可以通过调节GFP来改变FRET。把一个释放蓝色荧光的GFP融合到一个绿色荧光GFP突变体上，并在它们之间介入一个蛋白酶敏感的间隔子，这两个GFP恰好可以发生FRET，当加入蛋白酶时，间隔子被切除，两个GFP之间的距离发生弥散性改变，FRET被完全阻断。该实验提示我们，可以通过偶联GFP到适当的转录因子、跨膜受体、细胞间信号转导指示分子，来动态观测活细胞的生理功能。

在上述实验基础上，研究人员开始设计FRET依赖的Ca2+敏感指示剂，其设计原理是，钙调蛋白（CaM）通过肌球蛋白轻链激酶（MLCK）结合到CaM结合区。蓝色荧光蛋白和绿荧光蛋白通过CaM和MLCK区域融合在一起，当Ca2+增多时，形成更多的Ca2+CaM复合物，并从MLCK结合到CaM结合区域。该实验发现，通过改变两个GFP之间的距离，可以增加FRET。另有一些研究人员，并没有把两个GFP融合在一个单一结构中，而是把一个GFP融合到CaM上，另一个GFP融合到CaM结合区域。结果发现，当Ca2+结合到CaM上，出现分子间异源二聚体，两个GFP足够接近而产生FRET。这个实验提示了一个非常重要的现象，即FRET不仅可以在分子内发生，而且还可以在分子间发生。

最近，有学者用GFP依赖的生物传感器测量活细胞内生化动力学，通过利用带有GFP标记的蛋白激酶A转染细胞，观测有关cAMP的动态荧光变化。通过融合蓝色荧光GFP到调节亚单位或融合绿色荧光GFP到PKA的催化亚单位，设计出了cAMP传感器。当cAMP浓度很低时，两个荧光分子距离很近，并出现FRET，如果增加cAMP浓度，发生FRET的可能性急剧下降。利用该方法，可以检测出cAMP的动态变化,并开创了在整体条件下，研究cAMP调节信号转导途径的新方法。

GFP的结构虽然具有高度完整性，但是实验中发现，在GFP中某些确定的位置，插入外源基因，完全没有丧失其荧光性。当把CaM插入黄色荧光GFP突变体中，得到Ca2+传感器，当Ca2+结合到CaM上，导致生色团去质子化，使荧光强度增加7倍。当在黄色荧光GFP中插入一个Zif268锌指结构，可以得到传导Zn2+的GFP，结果发现荧光少量增加，为改变前的1.7倍，Kd值约0.4mmol。插入外源基因致使GFP荧光敏感性增强的现象，提供了一个获取永久编码传感器去监测细胞信号转导的新路径。

光伏发电

瑞典研究人员不再盯着植物作为样板，转而将目光投向拥有高超光伏转化能力的水母，开发出提升收获太阳能的技术。利用水母身上提取的绿荧光蛋白（GFP），该小组制作的装置可用这些“黏黏绿”将紫外光转化为自由电子。该小组制造的电池由在二氧化硅基底上被一个小缝隔开的两个简单的铝电极组成，GFP置于两电极中间并起连接作用。当把紫外光放进来的时候，GFP不断将光子抓走，并产生电子进入电路产生电流。同时，GFP非常廉价，不需要昂贵的添加剂或昂贵的加工，此外，它还能被封装成独立的不需要外光源的燃料电池。科学家相信，此能源装置缩小后可用来驱动微小的纳米设备。

在2008年的诺贝尔化学奖上，绿荧光蛋白成了主角。诺贝尔奖委员会将化学奖授予美籍日裔科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健三人，以表彰他们发现和发展了绿荧光蛋白质技术。在诺贝尔奖新闻发布会的现场，发言人取出一支试管，置于蓝光灯之下，只见这支试管中的物质发出了绿色荧光。

2008年的诺贝尔化学奖授予了从事有关“绿荧光蛋白质的发现，表达和发展”并取得重要成就的三位科学家：下村修、马丁·查尔菲和钱永健。

2008年诺贝尔自然科学奖颁布后，相关的介绍与报道铺天盖地。其中一条新闻很有意思，在诺贝尔化学奖得主下村修的出生地日本，养殖在一家水族馆里的一种多管水母也一夜成名，吸引了无数人前来参观，因为下村修正是从这种水母身上发现了后来让他获奖的绿荧光蛋白。其实下村修本人的经历，也如同这种水母一样：作为绿荧光蛋白的发现者，几十年来一直默默无闻，甚至他本人当初都没有预见到该项发现的价值。如果不是后来几位有技术、工程背景的研究人员在基础研究和实际应用之间架起桥梁，这项发现恐怕还淹没在论文堆中。与PCR（聚合酶链反应）技术一样，又一项与生物和生命科学有重要相关的技术获得了诺贝尔化学奖。