HCV蛋白及其功能

HCV蛋白首先被翻译成一条蛋白多肽，然后经细胞和病毒蛋白酶切割而成10个不同的病毒结构和非结构蛋白，其依次为C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B。另外一种由核心蛋白编码区经核糖体移码翻译而成的新蛋白，被命名为F或ARFP蛋白，其生物学特性和功能仍不清楚。在HCV感染者体内可检测到抗F蛋白抗体，说明F/ARFP蛋白也许与HCV复制或致病性有关。HCV结构蛋白包括核心蛋白（C）、包膜蛋白E1和E2。至于p7是否存在于病毒颗粒中仍不清楚。C、E1和E2同时在细胞内表达后可以产生病毒样颗粒（virus-like particle，VLP），不过，这种重组的病毒样颗粒并不具备感染性病毒的生物学活性。核心蛋白是由蛋白多肽的氨基端经细胞内的信号肽酶切割而成，具有多种不同的生物学活性，其主要功能是形成病毒的核衣壳。另外，C蛋白可与宿主细胞膜、核酸（RNA或DNA）及多种细胞蛋白质结合从而影响细胞正常信号的传递和功能，这有可能与丙型肝炎临床疾病的进展有关。已经证明C蛋白可影响脂质代谢，导致转基因小鼠肝脂肪变及肝细胞肝癌。E1和E2均为糖蛋白，二者通过非共价键结合形成异二聚体，主要介导病毒的吸附和细胞进入。E2与细胞表面的HCV受体或辅助受体结合，E1则可能在病毒与细胞膜融合后参与病毒的脱衣壳过程。除了介导病毒吸附外，非糖基化的E2还具有抑制干扰素（interferon，IFN）诱导的双链RNA激活蛋白酶（PKR）的功能，而PKR是介导IFN诱导的细胞内抗病毒防御的一种主要蛋白。因此，HCV有可能通过E2抑制PKR来抵抗细胞内的抗病毒防御功能。p7是一个大约7 KDa的疏水性小蛋白，在细胞内可能以六聚体形式存在，具有离子通道活性。金刚烷胺和多种长烷基链氨基糖衍生物可以抑制P7的离子通道，其他的p7抑制剂也已被发现并处于临床前研究阶段。另外，p7对于病毒颗粒的装配必不可少，但其具体的作用机理仍未阐明。HCV非结构蛋白包括NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，它们在病毒细胞感染周期中主要负责病毒蛋白质的切割和RNA的复制。此外，非结构蛋白可以抑制宿主细胞内的抗病毒防御功能以及宿主的免疫应答，还可能直接参与感染性病毒颗粒的装配和释放。NS2（23 kDa）是一种疏水性的Ⅲ型跨膜蛋白，是NS2/3蛋白酶的主要成分，其功能是负责在NS2与NS3蛋白之间的顺式切割。尽管NS2不直接参与RNA的复制，但对于病毒颗粒的装配和释放具有不可或缺的功能。另外，NS2也可能通过干扰细胞的正常功能而与病毒的致病性有关。NS3（70 kDa）具有多种酶活性，其氨基端的1/3是NS2/3蛋白酶的重要组成部分，同时作为丝氨酸蛋白酶，在辅助因子NS4A的协助下，负责病毒蛋白多肽NS3下游区域所有蛋白的切割（图1）。NS3羧基端2/3段具有解绳酶和核苷三磷酸酶的活性，对于HCV RNA的复制极为重要。NS3蛋白酶和解绳酶/核苷三磷酸酶的原子结构已被确定，为研发NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂起到了十分重要的促进作用，如今，多种NS3蛋白酶的抑制剂已处于临床前或临床研究中，估计不久将会被用于丙型肝炎的临床治疗。NS3还可能与HCV的慢性感染有关，已知NS3/4A丝氨酸蛋白酶能切割线粒体抗病毒信号传递蛋白（MAVS），从而阻断视黄酸诱导基因-I（RIG-I）介导的干扰素调节因子3（IRF-3）的磷酸化以及病毒感染诱导的I型干扰素的产生。因此，HCV可能通过NS3/4A蛋白酶活性阻断RIG-I和IRF-3介导的细胞抗病毒反应而得以在细胞内复制。NS3还与多种细胞蛋白质结合，但其在病毒复制和致病中的作用仍尚待阐明。NS4A是NS3丝氨酸蛋白酶的辅助因子，同时可协助病毒RNA复制体的膜附着。NS4B（27 kDa）为一种疏水的跨膜蛋白，是结合在膜上的HCV复制复合体的重要组成部分，但其在HCV复制中的具体功能尚不清楚。NS4B含有一个三磷酸鸟苷（GTP）结合位点，并且具有鸟苷三磷酸酶（GTP酶）活性。已经证明其GTP酶活性对于HCV RNA的复制非常重要。NS5A是一种磷酸化蛋白，主要以分子量56 kDa和58 kDa形式存在，NS5A可分为3个结构和功能特异的区域（Ⅰ，Ⅱ，和Ⅲ）。区域Ⅰ的原子结构已被确定，并揭示两个相同的NS5A分子通过氨基端的相互结合而形成一个二聚体。区域Ⅰ和Ⅱ在病毒RNA的复制中起着十分重要的作用，而区域Ⅲ对于病毒颗粒的装配极为关键。NS5A氨基端双亲性螺旋结构区镶嵌于细胞内的双层脂质膜上，其双亲性螺旋结构的破环可降低或阻断HCV RNA的复制，说明膜结合的NS5A对病毒基因组的复制至关重要。此外，NS5A还能与一种细胞内的膜相关蛋白hVAP-A（B）结合，已经证明hVAP-A（B）在HCV RNA复制中起着非常重要的作用，但其具体作用机制仍有待进一步阐明。NS5A还参与细胞凋亡的调控，细胞的生长增殖以及细胞内信号传递。类似于游离型E2，NS5A与PKR的相互结合同样可拮抗干扰素诱导的细胞内抗病毒反应。与核心蛋白一样，NS5A能干扰细胞内脂质及脂蛋白的新陈代谢。因此，NS5A不但与病毒 RNA的复制有关，而且通过影响正常细胞的代谢功能和拮抗细胞内的抗病毒机制而导致HCV的慢性感染。NS5B（65 kDa）为RNA依赖的RNA多聚酶（RdRp），它含有所有已知RNA聚合酶的基本结构。NS5B羧基端的21个氨基酸为高度疏水区，具有内质网膜附着的功能，尽管这段区域的删除并不影响其体外RdRp的活性，却可导致HCV RNA在细胞内复制的终止。NS5B也是磷酸化蛋白，不过，该蛋白的磷酸化对于RdRp活性及HCV RNA复制的作用仍不太清楚。NS5B的晶体结构已被解析，它的手指、手掌及拇指结构子域与其他聚合酶的典型结构类似，所不同的是其手指及拇指结构子域存在广泛的相互结合。另外，除了在RdRp酶活化中心的NTP结合位点外，在离活性中心约30?处的酶表面还含有一个低亲和性的GTP特异性结合位点，GTP特异性结合位点对于体外RdRp活性并不重要，但对于细胞内HCV RNA的复制却非常关键。NS5B可与NS3蛋白酶结合而增强NS3解绳酶的活性。NS5B与许多细胞蛋白质结合而催化RNA的复制及参与病毒的致病过程。细胞亲环蛋白（Cyclospphilin A）与N5SB结合来调控HCV RNA 的复制，亲环蛋白抑制剂环孢菌素A及其衍生物可阻断HCV RNA的复制，已进入治疗丙型肝炎的临床试验阶段。HCV前体蛋白的特性及在HCV复制和致病中的作用所知甚少。尽管前体蛋白4AB、4AB5A及4B5A能够在HCV亚基因复制子转染的人肝癌细胞中检测到，但对这些前体蛋白在HCV感染过程中的生物学作用却不清楚。细胞表达的NS4AB能够抑制内质网至高尔基体的物质运输，而单独表达4A、4B或同时表达4A和4B却没有这种作用，说明NS4AB前体蛋白很可能通过干扰宿主细胞蛋白分泌或转运而在病毒复制和致病性中发挥作用。

HCV基因组顺式调控信号

HCV RNA基因组5’端非翻译区含有病毒RNA复制所需的顺式元件和启动病毒蛋白多肽翻译的内部核糖体进入位点（IRES）。由多个茎环结构、膨出环状结构、及假结结构组成，可分为4种不同的结构域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）。结构域Ⅰ含有一个短的5’末端茎环结构，除具有提高IRES启动的翻译功能外，主要负责HCV RNA的复制。结构域Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ为IRES的组成部分，负责启动HCV蛋白多肽的翻译。结构域Ⅱ还参与病毒RNA的复制。此外，核心蛋白氨基端编码区含有两个茎环结构（Ⅴ和V1），参与调控IRES启动的翻译和HCV RNA 的复制。与其它正链RNA病毒一样，HCV NS5B羧基端编码区含有一个顺式复制元件（Cis-replication element，CRE），它能与3’末端第二个茎环上的碱基配对形成一个互吻环（图2），CRE的核苷酸序列及其2级和3级结构均对HCV RNA复制十分重要。3’端非翻译区含有3个独特的区域：可变区（VR）、多聚（U/C）区段、和3’端高度保守的98个核苷酸序列（图2）。3’端的98个核苷酸折叠形成具有3个茎环的2级结构。实验证明多聚（U/C）和3’端98个核苷酸对于HCV在黑猩猩体内的复制必不可少。可变区的核苷酸序列似乎还具有基因型特异性，并且对于HCV RNA在细胞内的复制非常重要，多聚（U/C）区和3’端98个核苷酸序列及其茎环结构对于HCV RNA的复制均起着关键性的作用。与5’端类似，3’端非翻译区也与多种细胞蛋白质结合，其中包括多聚嘧啶结合蛋白（PTB）、糖酵解甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。至于细胞蛋白如何与3’端非翻译区序列及其2级结构相结合，如何对HCV RNA复制进行调控仍尚待进一步研究。

HCV感染周期与病毒RNA的复制

HCV的细胞感染周期基本上与其他正股单链RNA病毒类似。病毒吸附于细胞膜表面的病毒受体或辅助受体，经受体介导的胞吞作用进入细胞。在胞内体酸性环境的诱导下，病毒膜与细胞膜发生融合，致使病毒RNA被释放到细胞浆内。然后，病毒RNA经核糖体通过内识别启动而翻译出一条病毒蛋白多肽，再经细胞肽酶和病毒NS2和NS3蛋白酶切割而形成单个的病毒蛋白质分子。病毒RNA和非结构蛋白NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B以及某些细胞蛋白共同在内质网膜上组装成HCV复制复合体，催化HCV RNA由正链到负链再由负链到正链的复制，最后，新合成的HCV RNA基因组和病毒结构蛋白装配成病毒颗粒，并从感染的细胞中释放。现研究发现，越来越多的细胞表面蛋白与HCV的吸附及细胞进入有关，包括CD81、低密度脂蛋白受体（LDLr）、葡糖氨基葡聚糖如C-型凝集素（DC-SIGN和L-SIGN）、高密度脂蛋白受体（SR-BI）、claudin蛋白和occludin蛋白。最近的研究表明CD81、SR-BI、claudin-1和occludin可能作为HCV的受体或辅助受体介导病毒的细胞进入，但其分子机理以及其他细胞表面蛋白在病毒吸附和细胞进入中的作用有待进一步阐明。HCV RNA的复制是一个非常复杂的生物反应过程，需要多种病毒和细胞蛋白通过蛋白-RNA和蛋白-蛋白相互作用来实现。HCV RNA的复制是在附着于核周内质网膜上的病毒复制复合体中进行，此复合体由病毒RNA和非结构蛋白NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B以及对HCV RNA复制起重要作用的细胞蛋白组成。NS5B的RNA聚合酶（RdRp）在RNA复制中催化RNA的合成，纯化的重组NS5B可以通过引物依赖（引物延伸）或非引物依赖（从头合成）的方式启动体外RNA的合成。与其他正链、负链和双链RNA病毒一样，HCV在体内以从头合成的方式启动RNA的复制。但是NS5B聚合酶本身缺乏模板特异性，需要与其他非结构蛋白以及细胞蛋白共同作用才具有HCV RNA复制的特异性。已经证明，所有HCV编码的酶（NS2/3蛋白酶、NS3/4A丝氨酸蛋白酶、NS3解绳酶/核苷三磷酸酶和NS5B聚合酶）对HCV在黑猩猩体内的感染和复制均必不可少。此外，许多细胞蛋白在HCV RNA复制中起着极为重要的作用，如脂肪酸合成酶和上述提及的亲环蛋白A（CypA），均可与病毒非结构蛋白结合从而对HCV RNA的复制进行调控。此外，细胞蛋白还可与HCV RNA基因组的5’和3’端非翻译区结合而影响HCV RNA的复制。尽管越来越多的细胞蛋白被揭示对HCV RNA复制起重要作用，但其在RNA复制中的具体功能和作用机制还有待进一步研究。

如今，对HCV复制机制的研究主要是应用体外重组系统，包括在细胞内表达HCV蛋白以及HCV RNA复制子。许多研究证明亚基因组和全长基因组HCV RNA都能在人肝癌细胞系Huh7中高效复制。另外，亚基因组HCV RNA还可在人非肝细胞，如Hela和293细胞中复制。HCV RNA亦可在小鼠肝癌细胞及胚胎成纤维细胞中复制。这些研究的发现表明HCV严格的嗜肝性不局限在RNA的复制上。然而，亚基因组HCV RNA在非肝细胞或小鼠肝细胞的复制仅限于少部分细胞，提示某些细胞中具有对HCV RNA复制的特异细胞因子。探明这些对HCV复制异常重要的细胞因子有助于阐明HCV复制的机制，并为抗病毒药物的研发提供新的靶点。更为重要的是我们实验室与国际上其他3个独立实验室于2005年同时建立了感染性HCV细胞培养系统，为研究病毒的细胞进入、复制及病毒颗粒装配和释放的分子机理奠定了基础。我们最近的研究证明，细胞的前脂蛋白E（ApoE）对于病毒颗粒的装配具有必不可少的作用。至于其他细胞蛋白是否也参与HCV感染、复制及病毒颗粒的装配已成为如今一大热门研究领域。今后对于HCV病原学的研究重点应该是阐明HCV结构蛋白在病毒RNA复制中的调控作用、HCV非结构蛋白在病毒颗粒装配中的功能、病毒和细胞蛋白在HCV复制中的确切作用及它们结构与功能的相互关系。更为重要的是需要建立可靠的HCV复制的动物模型，以阐明导致HCV慢性感染和诱化肝细胞癌的机理，以及研发安全有效的抗病毒药物和疫苗。