更新时间：2022-08-25 17:17
肠激酶 是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体 丝氨酸蛋白酶。分子质量为150ku, 由1条115ku重链和1条35ku轻链组成, 在pH值4.5～9.5、温度4～45℃范围内特异性水解蛋白底物。
由于经EK裂解融蛋白所释放的目的多肽具有和野生型完全一致的N-末端氨基酸序列, 因而可作为蛋白表达体系中融合蛋白的切割试剂。但是天然的肠激酶来源毕竟有限, 并且提取分离的成本高, 加之天然提取的肠激酶易为其它蛋白酶污染, 造成切割融合蛋白的同时又降解了目的产物。而基因工程的方法正可以弥补这些不足, 因而运用基因工程的方法生产肠激酶广为应用。商品化的肠激酶主要有两种:天然提纯的牛肠激酶和基因工程重组牛肠激酶。
天然肠激酶由1条结构亚基 (重链) 和1条催化弧基 (轻链) 构成, 两者通过1个分子间二硫键结合, 结构亚基负责将催化亚基固定在小肠刷状缘膜上并引导它向肠腔移动, 催化亚基可以特异性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下, 将胰蛋白酶原活化为胰蛋白酶, 从而启动各种酶原活化的级联。
重组肠激酶 (recombinant Enterokinase, rEK) 的分子质量通常为26.3ku, 具有3个糖基化位点, 其糖基化分子质量大约为43ku。Vozza等发现, rEK体外实验证明有全酶酶切特异性并且相较于天然肠激酶表现出对基因工程融合蛋白底物的酶切活性增强, 因而现多采用基因工程的方法生产肠激酶。近年来所做的尝试多是克隆与表达235个氨基酸的轻链 (recombinant Enterokinase light chain, rEKL) 。 Janska等研究氨基末端残基发现了EK轻链的三维结构与类胰蛋白酶等的丝氨酸蛋白酶的结构同源性。Seong等则发现将轻链氨基末端的Ile突变为Val其酶活JL乎不发生改变。另外, 有研究发现EK的重链强烈影响肠激酶对大分子底物的识别而对合成的融合蛋白或小分子底物的识别没有影响。
肠激酶在体内激活胰蛋白酶原转化为胰蛋白酶, 由于肠激酶的轻链结构在人、牛和猪中保守, 其识别序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys在脊椎动物中也有很强的保守性, 且几乎所有被定序的胰蛋白酶原都具有4个天冬酰胺相连的特征, 此序列在其他的天然蛋白质上又非常罕见, 而肠激酶的活性中心有1个特殊的阳离子位点, 使得有强大负电的Asp-Asp-Asp-Asp可以与此阳离子位点结合, 因此, 牛肠激酶的底物酶切位点序列具有高度的特异性, 这种特点使得EK成为基因工程融合蛋白表达后修饰过程中1个极其有用的工具而被广泛应用。对于EK酶切的高度特异性, Rumsh[8]认为是由于酶中钙离子的丧失使得酶自切割, 从而具备了激活其它酶的高度特异性。但是在实际的酶切反应中也可能产生一些非特异性的切割[3], 在基因工程研究中应认真对待此问题。
与大多蛋白的分离纯化方法类似, rEK可通过硫酸铵沉淀、DEAE柱、凝胶层析和透析等方法得到纯品, 另外, 运用组氨酸 (Histidine, His) 在蛋白末端进行标记, Nickel金属螯合柱亲和纯化这种低成本高效率一步分离蛋白的方法, 也正广泛地运用到rEK的分离纯化, 其收率可达50%以上。对于His-tag的位点, Choi等研究发现rEKL的C末端进行His标记, 用Nickel金属螯合柱亲和纯化后其酶活不发生改变, 而在N末端进行His标记后通过Nickel金属螯合柱则酶活丧失。
1.4 生理特点
1939年Kunitz证实肠激酶是胰蛋白酶原的生理激活剂, 而胰蛋白酶是消化系统其它许多酶原的激活剂, 因此肠激酶被认为是消化系统重要的起始酶之一。一般认为EK存在于小肠刷状源细胞膜上, Zamolodchikova等认为pro-EK是由十二指肠酶激活的。病理研究发现, 十二指肠与胰腺的回流液中富集EK会激活过多的胰蛋白酶原从而导致急性胰腺炎, 而EK缺陷的机体将会有腹泻、呕吐、浮肿等症状, 造成发育不良, 导致血蛋白不足症和贫血。