3、脂肪干细胞(ADSCs)在临床上的应用

干细胞的临床应用价值主要表现在其组织修复与重建中。ADSCs能向各细胞系分化，包括中胚层源的骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞、神经细胞及胰岛细胞。现在临床上主要的应用策略为转基因定向诱导、再经体外扩增干细胞后，移植入人体。

脂肪干细胞特点：1、自体干细胞容易与自身细胞结合；2、有助于网状成纤维细胞的增殖；3、可按要求诱导组织的生长及自体干细胞的迁移。

研究发现ADSCs细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。

传统的脂肪移植手段由于存在免疫排斥、炎症反应等缺陷难以得到让人满意的疗效。据统计，自体脂肪组织移植到缺损部位后，通常其中40%~60%会被吸收。通过患者自身的脂肪组织内的干细胞，来构建具有完整生物学结构和功能工程脂肪组织无疑将是解决这一难题的最佳方案。如何实现从干细胞到脂肪细胞的分化，是构建工程脂肪组织不可回避的问题。早在 2001 年，Zuk 等人发现脂肪干细胞以来，就已经证明脂肪干细胞具有向脂肪、软骨、成骨、成肌等多向分化潜能。传统的成脂诱导分化采用的方法多为混合诱导剂法。成脂诱导剂的不足是带有毒性，对人体有较大危害。

除了以上通过诱导剂进行体外诱导分化外，用成熟体细胞与干细胞共培养同样可以使干细胞定性诱导分化。2000 年， Maurin 等采用间接共培养的方式，研究脂肪细胞对成骨细胞扩增和活性的影响，并证明成熟脂肪细胞对人的成骨细胞的扩增有抑制作用;但对成骨基质细胞的扩增及活性，无显着影响。2003 年Shigehisa 等采用三维胶原凝胶中共培养脂肪细胞和内皮细胞的方式研究二者间的相互作用，得出结论：内皮细胞参与到脂肪组织形成和扩增的过程当中。2007 年， Wang 等通过实验证明，鼠来源脂肪干细胞在胶原凝胶三维体系中，与OECs (Olfactory ensheathing cells-嗅鞘细胞)共培养过程中，能够分化成为OECs-like(嗅鞘样细胞)。

综上所述，通过共培养方式体外诱导干细胞定向分化已经成为研究热点。因此，本研究尝试采用trans-well 间接共培养方式，对人体吸脂来源的干细胞与脂肪细胞进行共培养，并对比传统成脂诱导剂法，考察共培养条件下干细胞成脂分化的效果。

脂肪干细胞来源于中胚层，现已证明其具有向骨、软疾病种类临床阶段骨、脂肪、肌腱、神经、内皮细胞、肝细胞和造血方向分化的潜能。例如，脂肪干细胞治疗心肌梗死的可能机制包括以下几个方面：①向心肌细胞、血管内皮细胞分化，直接修复坏死心肌细胞。脂肪干细胞能通过减少心脏重塑，增加血管生成来提高心肌梗死后心功能恢复。②内分泌功能，可以通过促进毛细血管以及小动脉的生长来减轻心肌梗死后心脏的损伤以及提高心功能恢复。③外源性保护因子的作用载体。脂肪干细胞可能成为外源性基因在心肌梗死后心脏内表达的有效载体，对心功能的恢复有很大帮助。

1.实验仪器与材料

倒置荧光显微镜(IX71, Olympus);数字彩色摄像系统(Sony3CCD);图像分析软件(Image-pro-plus);离心机(Z23, Herm 德国);Transwell (3450-clear, corning, Costar 美国);纯水机(Millipore-Q-Synthesis, Millipore Ltd.法国);六孔板(Corning Incorporated 3516, Costar 美国)。

DMEM 培养基(高糖，GIBCO 公司);胰酶(GIBCO 公司);乙二胺四乙酸钠(上海试剂一厂);胎牛血清(兰州民海生物工程有限公司);Ⅰ型胶原酶(Sigma 公司);油红O(Sigma 公司);地塞米松(Sigma 公司);胰岛素(Sigma 公司);吲哚美辛(Sigma 公司);异丁基甲基黄嘌呤(Sigma公司)。

2.脂肪细胞培养

将吸脂来源的脂肪组织用D-Hanks 冲洗，去除残留的血细胞和组织碎片，把脂肪组织放入离心管中，记录原始体积。向组织中加入等体积的0.1%Ⅰ型胶原酶，放入37℃气浴振荡器中消化30 min。然后将消化好的组织静置5 min，待其分层后，用吸管吸取位于悬液上层的脂肪细胞，将含有脂肪细胞的悬液以1000 r/min(167g)，离心2 min 后弃掉下层悬液得到脂肪细胞。

3.脂肪干细胞的分离和培养

参照文献，同上述脂肪细胞的分离一样，将脂肪组织冲净，称重后消化。当消化完成后，弃掉上层未消化的脂肪组织，将下层的细胞悬液以1500 r/min(375g)，离心10 min 后弃上清，得到离心管底部的脂肪干细胞团，将其重悬，密度调整到1×105mL-1，然后接种在培养面积为25 cm2 的细胞培养瓶中。

当干细胞长满培养瓶后按一传二进行传代，具体的传代方法是：首先，用D-Hanks 冲洗一遍细胞，然后加入2 mL 的混合酶溶液(0.25%胰酶和0.02%EDTA)消化，当在显微镜下观察到细胞发生明显的变形，缩成球状后，立即用含有10%胎牛血清的培养基中止消化，并用吸管轻轻吹打瓶底部，确保细胞完全脱落分离到悬液中，再把细胞悬液置于离心机上，以1000 r/min (167g)，离心5 min。最后，将离心得到的细胞团重悬，调整密度为合适密度进行接种。

4.脂肪干细胞和脂肪细胞的共培养

将准备好的脂肪干细胞和脂肪细胞分别置于Transwell 的上室和下层中，脂肪干细胞与脂肪细胞的个数之比分别为1:5，1:1，2:1 和5:1(4 组分别命名为A、B、C 和D 组)进行共培养，其中每孔中脂肪细胞的数量均为1×105 个。以上每组均做平行实验(n=3)。

5.成脂诱导对照实验

将干细胞以1.5×105 每孔的密度接种在六孔板中，以正常培养基培养的样本为成脂分化实验阴性对照组，以成脂诱导培养基培养的样本为阳性对照组。具体方法是：向基础培养基(DMEM+10%胎牛血清)中加入1 μmol/L 的地塞米松、10 μmol/L 的胰岛素、200 μmol/L 的吲哚美辛和0.5 mmol/L 的异丁基甲基黄嘌呤，配制成脂诱导培养基，每周换2 次液，直到进行成脂染色观察为止，以上对照组均做平行实验(n=3)。

6.油红 O 和台盼蓝复合染色

用 0.5%油红O，对成脂诱导后的各组样本进行染色。具体操作方法是：先用D-hanks将样本细胞冲洗充分，然后加入油红稀释染色10~15 min，(油红O 稀释液配制方法:0.5%饱和油红O 原液按3:2(油红O:蒸馏水)加入蒸馏水，然后过滤，待用)，接下来用75%的乙醇溶液将样本分化至间质清晰，然后蒸馏水冲，最后再用台盼蓝对脂质以外的细胞核部分进行复染，并于100 倍镜下观察拍照。以每组样本随机选取5~10 视野进行拍照观察以考察共培养方法的成脂诱导分化效果。

7.流式检测

通过酶消化法将细胞收集到离心管中，细胞悬液调整密度为1×105 mL-1，800r/min(120g)，离心5 min，弃掉上清，用4℃的冷D-Hanks 冲洗重悬细胞，再次将细胞悬液以800 r/min，离心5 min，之后弃去上清。然后用D-Hanks 将细胞重悬至1 mL，加入抗体5~10 μL，避光，冰上放置30 min。用D-Hanks 冲洗，离心，弃上清，重复该冲洗过程2~3次，确保将未结合抗体除净最后，加入约200 至300 μL 的D-Hanks 制成悬液，用流式细胞仪检测。

8.Hoechst/PI 死活染色

弃掉旧培养基，用D-Hanks 冲洗除去残留培养基然后向每个Transwell 孔中加入质量浓度为1 mg/mL 的Hoechst 33342 大约10 μL，使其终质量浓度为10 μg/mL，37℃下避光反应10 min。待Hoechst 染色完成后，用D-Hanks 冲洗除净残余的Hoechst 染料接下来，再加入用PI 染液，使其终质量浓度为10 μg/mL，4 ℃下避光反应15 min，染色完成也用D-Hanks冲净残余染液最后，将染好的细胞置于倒置荧光显微镜下观察、拍照。

脂肪干细胞与文献中描述的相一致。均形态完整，生长状态良好，适合进行共培养的后续研究。为成脂诱导阴性对照组，表明脂肪干细胞不能自发生成脂质；在成脂诱导剂作用下，脂肪干细胞能够生成脂质，经统计约有20.3%的脂肪干细胞发生了成脂分化。其中脂肪干细胞与脂肪细胞之比分别为1:5，1:1，2:1 和5:1(其中每孔中的脂肪细胞数均为1×105个)，尽管在不同比例下对脂肪干细胞和脂肪细胞进行tranwell 间接共培养，然而经过8天共培养后，脂肪干细胞并不能象成脂阳性对照组那样产生脂质油滴。

此实验结果的原因可能是由于共培养的持续时间过短所致。据文献报导，成脂诱导分化的持续时间通常在1~2 周，即7~4d 左右。因此，有可能由于本实验中脂肪细胞与脂肪干细胞共培养时间过短，导致脂肪干细胞与脂肪细胞没能得到充分作用，所以不能实现成脂诱导分化。

基于上述分析，需延长共培养时间至20d，进一步考察共培养方式中干细胞成脂分化的可行性。

为脂肪细胞与脂肪干细胞经过20d 共培养后脂肪干细胞的Hoechst/PI 死活染色结果。Hoechst 染料对活的细胞具有特异性染色的特点，PI 则对死细胞特异性染色。从中可以看到，两组中的细胞均呈明亮的蓝色，说明细胞的活性很好。基本上看不到PI 染成红色的死细胞的存在。表明，本实验中，经过共培养后的脂肪干细胞，仍拥有良好的活性。

研究可以发现，共培养组a，d，g 3 组均未发生明显的成脂分化现象。经过成脂诱导剂诱导的3 个不同接种密度的阳性对照组中均出现成脂分化，成脂分化后的细胞内出现大量密集在一起的小脂滴，当小脂滴达到一定数量后，就会聚合成为较大脂滴。这些成脂分化的现象与文献中报道的脂肪干细胞成脂分化的过程相一致。通过观察c，f，i 3 组未加任何诱导剂，仅仅使用基础培养基培养的脂肪干细胞的阴性控制对照组，可以看到，脂肪干细胞均匀生长于培养界面上，经过20d 的培养细胞的生长状态良好，未发生明显细胞破碎和衰退死亡的改变。

通过分析可以看到，不同脂肪干细胞与脂肪细胞共培养比例下，共培养组B(共培养比例为1:1)和共培养组C(共培养比例为2:1)的流式结果，与相应的控制对照组B 和组C 相比，CD105 的表达发生下降(b,f,d,h)，CD105 表达分别是，共培养组B 为4.8%，对照组B 为12.4%；共培养组C 为1.3%，对照组C 为6.8%。而另外一个间充质细胞的特异性表面标记CD44，(a,c,e,g)，共培养组B 中为2.9%，对照组B 中为3.1%，没有显着变化；在另一共培养组C 中为0.9%，对照组C 中为5.4%，发生显着变化。

通过以上分析发现(f,g)，经过共培养的脂肪干细胞，其表面抗原CD105的表达发生明显的降低，其结果接近不表达。CD105作为间充质细胞特异表达的表面抗原发生这一改变意味着，脂肪干细胞在共培养过程中可能发生了一定程度上的分化。

采用人体吸脂来源的干细胞与脂肪细胞进行共培养，8d 之内不能促使脂肪干细胞成脂分化。且将共培养时间延长至20d 后，仍未能观察到脂肪干细胞发生明显的成脂分化现象。通过流式细胞仪对共培养的脂肪干细胞进行细胞表面抗原标记表达的分析，发现共培养后脂肪干细胞与非共培养对照组相比较，其中间充质细胞特异性表达标记CD105 发生明显降低，这就意味着本实验的共培养过程中，脂肪干细胞内部已发生一定程度的改变。

干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是生命的起源细胞，是形成人体各种组织器官的原始细胞。干细胞技术是生物治疗的前沿技术，称之为再生医学。干细胞是具有自我复制和多向分化的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的原始细胞。

干细胞是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为“万用细胞”。干细胞是指尚未分化的细胞，存在于早期胚胎、胎盘及其附属物、骨髓、外周血和成年组织中，它能够被培养成肌肉、骨骼和神经等200多种人体细胞、组织和器官。干细胞技术最显著的作用就是：能再造一种全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织和器官。

关键词：骨髓干细胞 脂肪干细胞 脐带脐血干细胞 种子细胞 干细胞培养与分化 干细胞移植干细胞与中医药。

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胚胎干细胞，脐带干细胞，脐血干细胞，羊膜干细胞，羊水干细胞，骨髓间充质干细胞，造血干细胞，肿瘤干细胞，精原干细胞，生殖干细胞，成骨干细胞，软骨干细胞，肌肉干细胞，神经干细胞，脂肪干细胞，心脏干细胞，气管干细胞，肝脏干细胞，胰腺干细胞，胃肠干细胞，内皮干细胞，角膜干细胞，皮肤干细胞，毛囊干细胞，乳腺干细胞，前列腺干细胞，涎腺干细胞等干细胞相关基础与临床研究成果，以及血液疾病的造血干细胞移植相关问题。

研究内容：干细胞研究的生物学特性、培养与分化、诱导技术、干细胞与微环境、干细胞与微小RNA调节、干细胞因子及相关因子、干细胞表型与鉴定、干细胞移植与免疫耐受、细胞移植与基因表达、细胞编程与表观遗传、干细胞保存与质量、干细胞实验动物模型等学术和技术的热点问题。

干细胞移植存在细胞来源少、免疫排斥反应和跨个体应用难等困扰。日前，一种解决上述问题的通用型干细胞已由设想成为现实。第三军医大学大坪医院野战外科研究所再生医学课题组在中国工程院院士王正国指导下，成功将同种异体脂肪组织分离并“加工”获得的低免疫源性种子细胞种植到组织工程骨仿生材料上，成功修复了约2.5厘米的大块骨缺损，而临床表明超过1厘米的骨缺损无法靠自身修复来完成重建。相关论文发表在《科学》增刊上。

2005年，王正国提出研究通用型干细胞的设想和目标。在张波研究员带领下，课题组比较研究了胚胎、骨髓、脂肪等多种来源的干细胞后，选定取材容易、创伤小和具有可控制的多向分化能力的脂肪组织作为解决干细胞来源的突破口。课题组锁定引起免疫排斥反应的关键因素——MHC（主要组织相容抗原复合体）。实验证明，经过基因修饰、改建的脂肪干细胞成功去除了免疫排斥反应，具有不致畸、不致瘤等生物安全性。

课题组先后用猪和恒河猴进行动物实验，提取它们的脂肪干细胞，转入人巨细胞病毒产物，下调MHC表达水平，使其成为通用型干细胞。然后将其种植到课题组自行研制、具有完全自主知识产权的第二代仿生组织工程骨支架材料上，成功地修复了猪和恒河猴2.5厘米的大块骨缺损。实验证实，3个月后，移植的外源性基因逐渐丢失和降解，自体新生骨组织逐步取代移植组织。

该方法为临床制备大量“通用型种子细胞”提供了可能。预计在不久的将来，移植配型或将成为历史。