茎尖培养法脱除植物病毒的技术关键

（1）、被脱毒植物携带病毒的诊断及其在体内的分布

再脱毒之前，应了解植物携带何种病毒，病毒在体内的分布位置，以确定培养茎尖的大小

（2）、母体植株的选择和预处理

母体的选择

欲脱毒材料的品种典型性：关系到脱毒以后的脱毒苗是否保持原品种的特征特性

植体健康程度选择：应选感病轻、带毒量少的健康植株作为脱毒的外植体材料，这样更容易获得脱毒株。

茎尖的剥离

在剥取茎尖时，把茎芽置于解剖镜下（8~40倍），一只手用镊子将其按住，另一只手用解剖针将叶片和叶原基剥掉，解剖针要常常蘸入90%酒精，并用火焰灼烧以进行消毒。但要注意解剖针的冷却，可蘸入无菌水进行冷却。当一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将分生组织切下来，为了提高成活率，可带1-2枚幼叶，然后将其接到培养基上。接种时确保微茎尖不与其他物体接触，只用解剖针接种即可。剥离茎尖时，应尽快接种，茎尖暴露的时间应当越短越好，以防茎尖变干。可在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行操作，有助于防止茎尖变干。

将接种好的茎尖置于25℃左右的温度下。每天以16小时 2000-3000lx的光照条件下培养。由于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎尖需数月才能成功。

继代培养得到足够的检测苗、进行病毒检测。

脱毒效果检测

A 指示植物鉴定(indicator test plants) 所谓指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状的寄主植物。

每种病毒都有自己敏感的植物，例如：

马铃薯病毒的敏感植物有千日红、黄花烟、心叶烟、毛叶曼佗罗

大丽花病毒的敏感植物为：矮牵牛、黄瓜、苋色蓠

菊花病毒：矮牵牛、豇豆

摩擦接种法

取培养植株的叶片置于研钵中，加入少量的水和等量的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0），磨成匀浆，将其涂抹在指示植株叶片上，在指示植物的叶片撒上金刚砂，通过轻轻摩擦使汁浸入叶片表皮细胞而又不损伤叶片。5分钟后用清水清洗叶面。将指示植株放于防蚜虫网罩的温室内。然后视其病斑的有无，来判断是否脱除了病毒。

例如：植物液接种后如使千日红叶片枯斑，黄花烟、心叶烟呈花叶，证明该植物体内具有马铃薯X病毒

嫁接法

有些病毒不是通过汁液传播，而是通过专门的介体传播的，例如草莓黄花病毒、草莓丛枝病毒是通过一种特殊的蚜虫为介体进行传播的。这种病毒的鉴定，需将培养植株的芽嫁接在敏感植物上，根据敏感植株的病症来判断是否脱除了病毒

(serologic test) 试管沉淀反应；免疫双扩散；酶联免疫吸附测定(ELISA)。

试管沉淀反应

在抗原-抗体最适比例的条件下，观察有无沉淀的产生来确定被测植株是否带病毒。试管沉淀反应操作简单，需注意的问题：

①、叶绿体的自发凝聚

可用磷酸缓冲液提取汁液，再用氯仿处理除去叶绿体，pH 保持在（6.5-8.5）

② 、抗原抗体的比例要适当，当抗原过量时回抑制沉淀的形成

免疫双扩散

在半固体凝胶中测定在其中扩散的抗原和抗体间的沉淀反应的方法。与沉淀法比较起来有两个优点：一是节约血清，二是汁液不用特殊处理。

步骤：

①倒胶，一般厚2mm

②打孔，多打成梅花型

③加样，加血清和汁液。

一般加样后在37℃恒温过夜，即可进行结果观察。有扩散沉淀的即为带毒株，没有则为不带毒株

酶连免疫吸附测定

（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）

它是将抗原、抗体的免役反应和酶的高效催化反应有机结合起来的一种综合性技术。即通过化学的方法将酶与抗体或抗原结合起来，形成酶标记物。然后将它与相应的抗原或抗体起反应，形成酶标记的免疫复合物。结合在免疫复合物的酶，在遇到相应的底物时，催化无色底物生成有色底物，通过比色计可以准确测定。优点是灵敏度高，测定快速，每次可以同时测定多个样品。

C 电镜检查法

采用电子显微镜，可直接观察样品材料有无病毒存在，还可以进一步鉴定病毒颗粒大小、形状和结构，这些特征相当稳定，因此电镜检查法即准确又有效，但需要有一定的设备和技术。

D 分子检测法

例如RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reation）将待测的样品的总RNA与cDNA合成的试剂盒进行反应，合成cDNA，然后利用病毒DNA特有的序列设计引物进行PCR反应，即可知道在寄主中是否有病毒基因的表达

n 脱毒苗的离体保存与繁殖:一般是在实验室进行，一般每月继代一次，可以在培养基中加入生长延缓剂，如B9和矮壮剂可2-3个月继代一次，也可放到液氮或4℃冰箱中保存

n 建立脱毒种苗生产繁殖网络体系：如果试管苗生产成本过高或移栽困难，可将试管苗选择种植在一定的控制区域，从繁殖技术和环境隔离上保证较高水平，使得繁殖的种苗能有效的防止病毒的再侵染

（5） 影响脱毒效果的因素

母体材料病毒侵染的程度:单一病毒感染的植株脱毒较容易,而复合浸染的植株脱毒较难。

外植体的生理状态:顶芽的脱毒效果比侧芽好,生长旺盛的芽比休眠芽或快进入休眠的芽好。

起始培养的茎尖大小:不带叶原基的生长点培养脱毒效果最好,带1-2个可获得40%脱毒苗。

马铃薯易感染多种病毒，导致薯块变小、畸形、种薯退化等。实验证明，利用茎尖组织培养结合病毒检测，进行马铃薯脱毒，进而生产脱毒种薯用于生产，可有效地防止种薯退化，大幅度提高马铃薯产量。其主要脱毒方法如下：

1．取材和消毒将欲脱毒地品种块茎催芽，芽长4-5cm时，剪芽并剥去外叶，自来水下冲洗40min，于无菌室内用漂白粉溶液消毒后，无菌水冲洗2～3次。

2．剥离和接种在无菌室内，于40倍地解剖镜下，剥取带1个叶原基地茎尖，接种于MS茎尖培养基地试管中。试管中的MS茎尖培养基包括大量元素、微量元素、有机成分和生长素、细胞分裂素、蔗糖和琼脂，pH值为5.7，经高压灭菌后使用，每试管接种1个茎尖。

3．培养条件接种的茎尖培养于25C、1500-3000LX光照条件下培养室内，3个月则长成3-4片叶的小植株。在无菌条件下，进行切段扩繁一次，取部分苗进行病毒检测。

4．病毒检测病毒检测是茎尖脱毒不可缺少的步骤，常用鉴别寄主即指示植物或血清学方法进行检测，及时淘汰血清学阳性反应或在指示植物上有症状的茎尖苗，无任何反应的茎尖苗即脱毒苗用作繁殖。