发射光谱

固定激发波长，记录在不同波长所发射的荧光的相对强度，即得发射光谱。

荧光强度

荧光的相对强弱，与很多因素有关，可用（1）式表示：式中F表示荧光强度，K是仪器常数，Φ为荧光量子产率，I0是激发光强度；ε是样品的克分子消光系数；b为样品池的光径长度；c为样品浓度。当浓度很稀时（1）式可近似为（2）式：

从此式可知，在低浓度等件下，样品浓度和荧光强度呈线性关系。

量子产率

量子产率一般用Φ表示，其定义如（3）式所示：

荧光寿命

用τ表示荧光寿命，并以（4）式定义之：（4）

该式表达了荧光物质被一瞬时光脉冲激发产生的荧光随时间的衰减。荧光寿命τ就是荧光强度下降到最大荧光强度F0的1/e时所需要的时间。

荧光偏振

荧光偏振常用偏振度表示，其定义如（5）式：

式中F∥表示激发光起偏器和荧光检偏器的透射轴方向平行时测得的荧光强度；F⊥是上述两方向互相垂直时的荧光强度。当 P=0时，说明完全不偏振；P在-1至+1之间即为部分偏振。

荧光技术在生物化学及分子生物学研究中应用主要包括以下几个方面：

1、物质的定性：不同的荧光物质有不同的激发光谱和发射光谱，因此可用荧光进行物质的鉴别。与吸收光谱法相比，荧光法具有更高的选择性。

2、定量测定：利用在较低浓度下荧光强度与样品浓度成正比这一关系可以定量分析样品中荧光组分的含量，常用于测定氨基酸、蛋白质、核酸的含量。荧光定量测定的一个优点是灵敏度高，例如维生素B2的测定限量可达1毫微克/毫升，这一优点使测定时所需要样品量大大减少。

这种定量测定方法还可应用于酶催化的反应，只要反应前后有荧光强度的变化，就可用来测定酶的含量及酶反应的速率等。

3、研究生物大分子的物理化学特性及其分子的结构和构象：荧光的激发光谱、发射光谱、量子产率和荧光寿命等参数不仅和分子内荧光发色基团的本身结构有关，而且还强烈地依赖于发色团周围的环境，即对周围环境十分敏感。利用此特点可通过测定上述有关荧光参数的变化来研究荧光发色团所在部位的微环境的特征及其变化。在此研究中，除了利用生物大分子本身具有的荧光发色团（如色氨酸、酪氨酸、鸟苷酸等，此类荧光称为内源荧光）以外，可将一些特殊的荧光染料分子共价地结合或吸附在生物大分子的某一部位，通过测定该染料分子的荧光特性变化来研究生物大分子，这种染料分子被称为“荧光探针”，它们发出的荧光一般称为外源荧光。荧光探针的应用，大大地开拓了荧光技术在分子生物学中的应用范围。

4、利用荧光寿命、量子产率等参数可以研究生物大分子中的能量转移现象：通过该现象的研究，可以获得生物大分子内部的许多信息，如分子内两荧光基团D, A之间的临界距离可根据弗尔斯特公式来测定，弗尔斯特(Förster)公式如（6）式所示：

即是两荧光发色团之间的能量传递的速率KDA和它们之间的临界距离Ro的六次方成反比。式中的KDA、K、J等均可由荧光寿命、量子产率及荧光强度的测定来推算，从而可以得知两基团之间的距离。

以往人们常用荧光偏振做指标来研究生物大分子动力学。近年来人们趋于用荧光偏振随时间的衰减来研究这些问题。在这种方法中，激发光不是一连续的面偏振光，而是一偏振的光脉冲，因此测得的F∥和F是在两个不同方向上偏振的荧光随时间的衰减，它既和荧光寿命τ有关，又与分子在溶液中的运动有关，因此常表示为F∥（t）和 F⊥（t）。由它们可得一相当重要的物理量——各向异性参数A（t）。

由A（t）可推测生物大分子的形状、分子转动弛豫时间（即从一个定向的状态到一个无定向状态所要的时间），进而可以推知生物大分子的大小、分子在溶液中的转动角度和时间之间的函数关系。由这些结果可以研究分子之间的相互作用、分子间结合的紧密程度、蛋白质、核酸分子的解聚程度等等。

另外，荧光技术在免疫学中亦有广泛的应用。最重要的就是荧光抗体法。将某些荧光染料与血清抗体相结合，这种标记的抗体仍可专一地与相应抗原发生结合，形成的复合体具有荧光特性，从而可以确定抗原或抗体的存在及其含量。

5、在医疗诊断中的应用之DNA测序荧光染料： DNA序列的破译是新世纪基因工程研究的重要前提。近年来，DNA测序的新技术、新方法不断涌现，荧光染料标记DNA的基因芯片技术使其中最引人注目的。在荧光染料标记DNA测序技术中所用的荧光染料要求是：吸收光谱应在可见光区发射，光谱尽量靠近红光区，以避免DNA自身的蓝色荧光干扰；能发射足够强度的荧光；不影响DNA片段在电场中的泳动；染料本身无毒害。

用于DNA序列的荧光染料主要是咕吨类化合物、菁类化合物、1,8-萘酰亚胺类染料以及二吡咯烷硼二氟类染料，荧光多为黄、绿、红色，荧光量子产率较高。

6、荧光技术在医疗诊断中的应用之光动力治疗用色素： 将特定的光敏感材料注入体内，它富集在肿瘤组织内，在正常细胞组织被代谢排除体外。用适当的光激发，可以检测出癌症病处，再用特定波长的激光激发，产生能破坏肿瘤组织的自由基物质或引发氧分子转变为能杀灭癌细胞的单线态氧，达到治疗的目的。

光动力疗法是除手术、化疗和放射疗法之外的第四种治疗肿瘤的方法。它副作用小，不会引起外貌损伤。由于光动力疗法具有高度的选择性，破坏肿瘤组织临床使用的光敏化材料多为卟啉类化合物。由于光动力疗法的优异性能，已成为世界各国的研究热点。

荧光技术中应用的主要仪器有荧光分光光度计和毫微秒荧光计。

荧光分光光度计

该仪器的基本结构主要由激发光源（常用氙灯）、激发单色器、发射单色器、样品池及检测器（光电倍增管）等组成。和一般分光光度计不同，荧光检测是在与激发光垂直方向上进行。结果的显示方式有记录仪、表头、数字显示、打印机等。一些高级荧光分光光度计还连有微处理机处理数据，可进行光谱积分、微分、本底扣除等。在荧光分光光度计的激发光路和发射光路中分别插入一块偏振镜，并使之可以旋转，即可进行荧光偏振的测量。利用荧光分光光度计，可进行荧光激发光谱、发射光谱、量子产率、荧光强度等参数的测定。

毫微秒荧光计

根据工作原理的不同可分为毫微秒脉冲荧光计、位相式毫微秒荧光计，单光子计数毫微秒荧光计等。第一种仪器的原理如图《毫微秒脉冲荧光计原理图》示，用一持续时间极短的光脉冲（大约在毫微秒数量级，10－9秒）激发荧光样品，产生的荧光用快响应的光电倍增管或其他光电转换器件转换成电信号，在相应的示波器上显示出荧光随时间衰减的曲线，用计算机处理该曲线即可得到荧光寿命及其他有关参数。滤光片是用来选择合适波长的激发光和荧光。偏振片用于测量各向异性常数A（t）。利用毫微秒荧光计可以测量荧光寿命、荧光偏振随时间的衰减等参数。