构建蛋白质阵列文库的第一步是建立全长cDNA表达文库，再将cDNA文库转化成蛋白质文库。原则上所有cDNA都可以用于蛋白质文库的构建，然而大多数蛋白质因不具备体外可检测的生物活性，因而不适于文库筛选。目前能适用于体外高通量功能筛选的蛋白质主要有细胞膜“表面蛋白”和“分泌型蛋白”。大部分分泌型蛋白质在氨基末端含有20至40个氨基酸的信号肽。而膜蛋白均含有跨膜疏水性的α螺旋结构。利用计算机程序可以预测这两类蛋白，从而挑选相应的cDNA构建蛋白质阵列文库。一旦cDNA文库确定后，可将cDNA克隆到表达标记蛋白的载体内，应用高通量自动化的蛋白表达系统来表达和纯化带有标记的靶蛋白。