1965年入永隆影业公司，参加拍摄台语片。1966年入国联影业公司。1970年因在影片《苦情花》中扮演角色，获第十六届亚洲影展最佳女配角奖。1970年入中国电视公司，参加拍摄闽南语电视连续剧，期间也参加拍摄影片。

陈佩伶很小就出道，以演出台语片为主，以电影「苦情花」获得第十届亚洲影展最佳女配角奖。17岁与导演陈俊良结婚，离婚後独力扶养二女，後来中视开播，她演出闽南语连续剧「哑巴与新娘」、「一代女皇武则天」、「她的一生」等。

陈佩伶还是中视闽南语连续剧中的常青树，其演技的精湛，内心戏的表达收放自如，正是「一代女皇」制作单位找她演剧中严肃善妒的王皇后的主因。《一代女皇》的重点虽是武则天──潘迎紫，但是为了戏剧效果，编剧强化了王皇后──陈佩伶的份量，让两人在宫中对立，达到冲突的效果。