马可·波罗出生于威尼斯波罗氏商人家族。他祖父名安得利亚·波罗，生三子：长名马可，次名尼柯罗，季名马菲奥。马可波罗是尼柯罗·波罗之子，他的名字与他伯父的一样，是有意纪念其伯父的。三人俱以经商为业，老马可先在君士坦丁堡（今伊斯坦布尔）开业，其后又向东在黑海北岸克里米亚半岛东南岸的索尔得亚设立货栈。他的两个兄弟也步其后尘，向东方发展其事业。

公元1260年，尼柯罗和马菲奥携带货物自威尼斯出发到达君士坦丁堡，在那里买了许多珍宝，又渡海至索尔得亚，再由陆路前行至钦察汗的国都萨莱，受到汗国国王别儿哥（1257～1266年在位）的欢迎。他们留居一年之后想回故乡，恰逢别儿哥为争夺伊利汗的阿塞拜疆地区与该国君主旭烈兀发生战争，回乡原路不通，听人建议折向东行，到达察合台汗国的不花剌城（今乌兹别克斯坦的布哈拉），停留约三年，在1264年碰到元朝派往西方的使者，决定随同东行到中国。约于1265年，到达元朝的都城上都（又名开平府），受到元世祖忽必烈的接见，忽必烈写了一封信给教皇，托尼柯罗兄弟带回罗马，并受命出使罗马教廷，请教皇选派精通教义的教士百人来华，并从耶稣圣墓的长明灯上带点圣油来。

尼柯罗兄弟回到意大利，此时第八次十字军东征刚刚结束，第九次东征正在筹划中。他们拿到教宗额我略十世给忽必烈的回信，于1271年夏季，会同两名教士和尼柯罗的小儿子马可·波罗起程东来。从威尼斯乘船到黑海南岸登陆，然后从陆路辗转。途中，二教士畏难退回，波罗一家则继续前进，终于在1275年(元世祖至元十二年)夏季抵达元朝皇帝避暑、议政的上都（又名开平府），随后又抵达大都（北京）。马可的聪明一直非常讨忽必烈喜欢，封他许多官，也派他到各地为元朝皇帝的使者。据马可波罗自述，“由于他聪明谨慎，并学会几种文字（可能是蒙古、突厥、波斯文等），甚受大汗宠爱，命令他出使各地，都使大汗满意，因此他们在中国住了十七年。”

波罗一家久居异国，思回故乡而不得允许。直到最后，由于伊利汗国王阿鲁浑（Argon）的皇后卜鲁罕去世，遗嘱必须其同族女子继其后位。阿鲁浑派三位使臣到元廷求婚，忽必烈选一位十七岁少女阔阔真（Cocacin）出嫁，波罗一家以护送三使及该女为由得到准许，于1291年初从泉州出发，航行二年多时间，完成使命。1295年他们回到威尼斯。阿鲁浑所派三使臣名字是Ulatai，Apusca，Coja，这三个名字在《永乐大典》卷一九四一八引元修《经世大典·站赤》中一道公文内都能找到，他们是兀鲁解（音歹）、阿必失呵、火者，是在至元二十七年(1290年)奉旨“取道马八儿，往阿鲁浑大王位下的”。

1296年，热那亚城的舰队来犯。马可·波罗参加威尼斯与热那亚之间的海战。战败被俘，在监狱里花了几个月将他在中国的经历给狱友听。同狱中有一比萨（Pisa）市人鲁思蒂谦诺（Rustichello或Rusticiano），是一善于撰写骑士传奇小说的文人，将他口述内容记录下来，马可也托人把他在东方时作的有关札记弄来作为补充，1298年，《游记》书稿完成，由于马可·波罗在给狱友描述自己在中国等地的见闻时，老是说“百万这个，百万那个”，故他被人称作“百万先生”，而这本游记也因此被称作“Milione（百万）”。在中国、日本等地则被称为《马可·波罗游记》、《东方见闻录》等。

1299年，马可·波罗获释，并回到威尼斯。

1324年，马可·波罗在威尼斯逝世，享年69岁。

马可·波罗是第一个横穿亚洲大陆并作出详细记录的人，对中国的内地和边疆，对亚洲其他国家和民族的政治社会情况、风俗习惯、宗教信仰、土特产品、轶闻奇事，一一笔之于书，虽朴实无华，但生动有趣。在他以前和以后来华的西方人留有行纪的也不少，在文采和对某一事件的记叙方面也许远胜于他，但像他这样记事之广、全面概括的著作却绝无仅有。特别是，他对元代中国的记载不仅充满热情，而且比较客观。他对所到之处的富庶和文明，总是热情称道，说明他对中国和中国人民怀有友好的感情。他是友好的使者，为中国和意大利人民架起了友谊的桥梁。《马可·波罗游记》向西方展现了迷人的中国文明，开阔了欧洲人的眼界，由最初把它视为《天方夜谭》逐渐认识了它的真正价值。

1375年（明洪武八年）由法国国王查理五世（1338～1380年）监制的喀泰兰（Catalan）地图（存于巴黎大图书馆），其东亚部分完全取材于马可之书。此图作者摒弃伪科学和宗教成见，以多种资料为根据力图反映当时世界的实况，不愧为一代杰作。其图的中亚与东亚部分皆据《游记》而成。《马可·波罗游记》对十五世纪以来的欧洲航海事业的发展也起了推动作用。

著名的意大利航海家哥伦布（1451~1506年）曾熟读此书，并在其所读拉丁文《马可·波罗游记》中加了45处的标记。他对中国和印度的文明富庶极为艳羡，特别是对日本国的无数黄金更为垂涎。他在1492年奉西班牙女王和国王之命，携带致中国皇帝的国书，横渡大西洋，到达巴哈马群岛和古巴、海地等岛。以后又三次出航，到达中、南美洲诸岛及大陆沿岸地带。这是发现新大陆的开始，但他并不自觉，还以为到了马可波罗书中的东方世界。他把古巴岛当作日本国，并登岸寻找黄金，又把墨西哥当作“行在”（杭州）。他称当地人为印度人（Indians，汉译为避免与亚洲印度人混同，称印第安人）。现如今墨西哥湾、加勒比海与大西洋之间的岛群，仍称为西印度群岛，可见马可波罗书影响之大。

《马可·波罗游记》不仅使西方人了解中国，向往中国，成为中西文化交流史上的重要文献之一，也对中国人了解元代的历史有所帮助。从历史文献学的角度看，《马可·波罗游记》中所叙述的许多情节，大都可以和中国史籍印证。

马可波罗的中国之行，“对于中、意两国历史具有十分特殊的重要性”，他的那次旅行“向西方展现了迷人的中国文明”，并为意大利历史上有这样一位伟大的旅行家而自豪。——意大利代表芬奇在1971年联合国第二十六届大会上

马可·波罗具体的出生日期和地点并不是很清楚，当前的说法都只是推测。大多数历史学家接受的可能的出生地是威尼斯共和国首都威尼斯。有些传记作家认为，马可·波罗出生在科尔丘拉岛（现属克罗地亚），但没有证据支持。使用最多的马可·波罗的出生时间是“大约公元1254年”。他的父亲尼科洛和叔叔马费奥在其出生前就已经出发去做生意了。马可·波罗的母亲很早就去世了，由姑妈和叔叔带大。曾受过很好的地理教育，学习了许多商业科目（如外国货币、估价、管理货船），但是对拉丁语所知不多。

马可·波罗是否到过元帝国，一直惹来重大争议。大多现代历史学家相信马可·波罗确实到蒙古人统治下的中国，因为他描述了远东生活的很多细节，如纸币、大运河、蒙古军、煤炭、白酒、石棉、虎，皇家邮政系统的结构。他提到蒙元对日本古称，是日本在西方文学里第一次出现；他描述的大都附近的一座桥也较像卢沟桥。也有学者认为是马可·波罗只在中东黑海遇上多名伊儿汗国商人，从其口中听说华夏、蒙古帝国、日本等地的故事，实际上从未到过距离黑海数千公里之遥的远东多国。大英图书馆的中国文献部门主管弗朗西丝·伍德曾在1995年出版《马可波罗到过中国吗？》，指出马可·波罗在游记中从未提及过缠脚、筷子及万里长城等中国事物，中国官方文献亦无马可·波罗家族与中陆有直接联系的记录，其家族财产中甚至没有任何来自中国的物件，因此推测他根本未到过中国。

德国图宾根大学的汉学教授傅汉思在其著作《马可·波罗到过中国：货币、食盐、税收方面的新证据》一书中说明：马可·波罗传记中很多对中国的描述是独一无二并且十分准确的，足以证明其真实性。例如对他为何从未提及长城的质疑，中西方历史学界早有共识，认为元朝以前的古长城那时已经完全残破而不再受人关注，而现今举世闻名的明长城自然尚未出现。又如对现存的中国文献中为何找不到关于马可·波罗记载的质疑，傅汉思认为是对中国古代文献性质与密度的严重误判，因为即使是同一时期教宗本笃十二世派往中国的特使团，也从未出现在中国历史文献中。傅汉思认为，马可·波罗对当时中国的货币、食盐生产与税收体制的大量详细描述，这在当时的欧洲、阿拉伯或波斯文献中根本找不到类似的准确而详尽的描述，说明这些独家描述确实来自于他本人的经历。

南开大学史学家杨志玖教授曾在永乐大典残片《站赤》中找到一条记载——“兀鲁得、阿必失和火者，取道马八儿，往阿鲁浑大王位下”，伊儿汗国的拉施特在《史集》中记载合赞迎娶阔阔真时，也提到火者等使者，与《马可波罗游记》中记载护送阔阔真的使者名字一致，成为证明马可波罗到过中国的有力证据。

2024年4月份，为纪念马可·波罗逝世700周年，威尼斯市政博物馆基金会与上海博物馆联合主办的“马可·波罗的世界”展会在意大利威尼斯总督府举行。

2024年5月3日至4日，歌剧《马可·波罗》在广州大剧院舞台再次上演。