更新时间：2024-04-08 16:41
鬼笔环肽（phalloidin），是从一种剧毒蘑菇(Amanita phalloides（Vaill ex Fr.）Secr.) （伞菌目，毒伞属的毒伞）中分离出来的一种多肽物质，属于毒伞肽类毒素，是一种强烈毒素。无色，细针状结晶。鬼笔环肽中毒的主要症状是由于肝细胞的破坏引起的急性饥饿。它通过结合和稳定丝状肌动蛋白（F-actin）发挥功能，并有效防止肌动蛋白纤维解聚。由于其与F-肌动蛋白的紧密和选择性结合，含鬼笔环肽的荧光标记已广泛用于显微术中，以在生物医学研究中可视化F-肌动蛋白。
鬼笔环肽是最早发现的环状肽之一。它是从Amanita phalloides中分离出来的，并于1937年由Feodor Lynen和Ulrich Wieland结晶。它的结构不同寻常，因为它包含一个半胱氨酸-色氨酸键，形成一个双环七肽。这种连接以前没有被表征过，这使得鬼笔环肽的结构阐明变得更加困难。他们使用紫外光谱法确定了硫原子的存在，并发现该环结构的波长稍有偏移。雷尼镍实验证实了色氨酸环中存在硫。研究人员发现脱硫的鬼笔环肽仍然是圆形的，这表明鬼笔环肽的结构通常是双环的。线性化后，Wieland和Schön于1955年通过“ Edman降解”阐明了脱硫鬼笔环肽的氨基酸序列。
由于其对肌动蛋白的高亲和力，科学家发现了其潜在用途，可作为一种染色剂有效地观察肌动蛋白显微镜检查。与荧光团缀合的衍生物被广泛出售。由于其能够选择性结合丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）而不是肌动蛋白单体（G-肌动蛋白），荧光标记的鬼笔环肽比抗肌动蛋白的抗体更有效。
与鹅膏毒碱（amanitin）一起存在，毒性比鹅膏毒碱弱，对小鼠的致死剂量是50微克，对人体也有很强的毒性，可引起流涎、呕吐、便血、发绀、痉挛、肌肉挛缩，以致死亡。它同细胞松弛素B的作用相反, 只与聚合的微丝结合, 而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后, 抑制了微丝的解体, 因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。通过让这种毒素连接于荧光染料上面，研究人员可以研究细胞的内部工作机制，窥视细胞如何分裂。通过这些观察，他们可以揭开癌症工作机制和组织生长之谜。
美国加州大学圣克鲁斯分校的两位化学家斯科特·洛基和劳拉·舒利斯科(Laura Schuresko)利用一种称为固相合成(solid-phase synthesis)的手法，制造出了鬼笔环肽的类似物质谷氨酸7-鬼笔环肽（Glu7-Phalloidin）。另一位科学家（Anderson MO）合成出了鬼笔环肽的另一类似物质丙氨酸7-鬼笔环肽（Ala7-Phalloidin）。
美国多肽公司（American Peptide Company, USA）的研究人员刘宝生（Baosheng Liu）和张建恒（Jianheng zhang）利用固相合成和液相合成相结合的方法成功合成出了鬼笔环肽。用化学法合成的鬼笔环肽其物理和化学性质与从毒蘑菇中提取的天然鬼笔环肽一致。
FITC和Rhodamin等荧光物质标记的鬼笔环肽可特异的与真核细胞的F-actin结合，从而显示微丝骨架在细胞中的分布。
鬼笔环肽是一种双环七肽，含有不寻常的半胱氨酸-色氨酸键。 编码鬼笔环肽合成的基因是死亡帽蘑菇中MSDIN家族的一部分，编码34个氨基酸的前肽。 脯氨酸残基位于七个残基区域的两侧，稍后将变成鬼笔环肽。 翻译后，必须对肽进行蛋白水解切除，环化，羟基化，使Trp-Cys交联形成色氨酸，并差向异构化以形成D-Thr。 这些步骤的顺序和确切的生化机理尚未完全了解。 必要的生物合成基因聚集在MSDIN基因附近。
34-mer的第一个翻译后修饰是通过脯氨酰寡肽酶（POP）进行蛋白水解切割，以去除10个氨基酸的“前导”肽。 然后，POP通过氨基酸1（Ala）和氨基酸7（Pro）之间的转肽作用使七肽Ala-Trp-Leu-Ala-Thr-Cys-Pro环化。 据信，接下来将通过Trp-Cys交联形成色氨酸。
由于鬼笔环肽因其结合和稳定肌动蛋白聚合物的能力而被开发利用，但细胞无法轻易吸收，因此科学家发现鬼笔环肽衍生物在研究中更有用。 本质上，它遵循典型的使用羟脯氨酸的小肽合成。 合成的主要困难是色氨酸的形成（半胱氨酸-色氨酸交联）。
以下是Anderson等人进行的一般合成机理。在2005年进行了ala7-鬼笔环肽的固相合成，其在残基7与鬼笔环肽的区别如下。 THPP代表四氢吡喃基聚苯乙烯接头，该接头用于在合成过程中将分子与固体支持物连接。 注意，下面的合成只是显示连接起始材料的键形成顺序的一般方案。 Ala7-鬼笔环肽以及鬼笔环肽的许多其他类似变体可用于相对于鬼笔环肽增加细胞吸收并附着荧光团，以帮助在显微镜下观察F-肌动蛋白。
鬼笔环肽的第一个全合成是通过固相和溶液相合成的组合实现的。 合成鬼笔环肽的物理和化学性质与天然鬼笔环肽相同。
以下为刘宝生（Baosheng Liu）和张建恒（Jianheng Zhang）所开发的鬼笔环肽全合成路线。主要通过四个步骤实现。
①合成鬼笔环肽关键二肽物料（包含4,5-二羟基-L-Leu及L-Ala）
②合成Fmoc-cis-Hyp(3,5-dinitrobenzoyl)-2-Cl-Trt Resin
③固相合成线性七肽
④液相关环及搭桥
鬼笔环肽结合F-肌动蛋白，防止其解聚并中毒细胞。 鬼笔环肽特异性结合在F-肌动蛋白亚基之间的界面，将相邻的亚基锁定在一起。 鬼笔环肽（一种双环七肽）与肌动蛋白丝的结合比与肌动蛋白单体的结合更紧密，从而导致肌动蛋白亚基从丝端解离的速率常数减小，这通过防止丝解聚而基本稳定了肌动蛋白丝。此外，发现鬼笔环肽抑制F-肌动蛋白的ATP水解活性。因此，鬼笔环肽以不同于G-肌动蛋白的构型捕获肌动蛋白单体，并通过大大降低单体解离的速率常数来稳定F-肌动蛋白的结构，这是与ADP捕获有关的事件。 总体而言，发现鬼笔环肽与肌动蛋白发生化学计量反应，强烈促进肌动蛋白聚合并稳定肌动蛋白聚合物。
鬼笔环肽在细胞中不同浓度下的功能不同。 当鬼笔环肽以低浓度引入细胞质时，它将聚合度较低的细胞质肌动蛋白和纤维蛋白吸收到稳定的聚集的肌动蛋白聚合物“岛”中，但不会干扰应力纤维，即厚的微丝束。Wehland等 还注意到在更高的浓度下，鬼笔环肽会诱导细胞收缩。
发现后不久，科学家将鬼笔环肽注射入小鼠体内，并通过IP注射发现其LD50为2 mg / kg。 当暴露于最小致死剂量时，这些小鼠死亡需要几天时间。 鬼笔环肽中毒的唯一明显副作用是极度饥饿。 这是因为鬼笔环肽仅通过胆汁盐膜转运蛋白被肝脏吸收。 一旦进入肝脏，鬼笔环肽会结合F-肌动蛋白，从而阻止其解聚。 此过程需要花费一些时间才能破坏肝细胞。 肾脏也可以吸收鬼笔环肽，但效果不如肝脏。 在这里，鬼笔环肽会引起肾病。
荧光鬼笔环肽（红色）标记内皮细胞中的肌动蛋白丝鬼笔环肽的特性使其成为研究F-肌动蛋白在细胞中分布的有用工具，方法是用荧光类似物标记鬼笔环肽并用它们对肌动蛋白丝染色以进行光学显微镜检查。鬼笔环肽的荧光衍生物在定位活细胞或固定细胞中的肌动蛋白丝以及体外观察单个肌动蛋白丝方面非常有用。开发了一种高分辨率技术，通过使用与荧光团曙红结合的鬼笔环肽（荧光素曙红）来检测光和电子显微镜下的F-肌动蛋白。在这种称为荧光光氧化的方法中，可以利用荧光分子来驱动二氨基联苯胺（DAB）的氧化，以生成反应产物，该产物可以使电子致密并可以通过电子显微镜检测。如果使用饱和量的鬼笔环肽，可视化的荧光量可以用作细胞中丝状肌动蛋白量的定量测量。因此，免疫荧光显微镜和显微注射鬼笔环肽可用于评估细胞质肌动蛋白在其聚合物形成的不同阶段的直接和间接功能。因此，荧光鬼笔环肽可以用作高分辨率研究肌动蛋白网络的重要工具。
共聚焦显微镜拍摄的荧光鬼笔环肽染色的U2OS细胞的反卷积图像
鬼笔环肽比通常用于标记细胞蛋白以进行荧光显微镜检查的抗体小得多，该抗体可以对丝状肌动蛋白进行更密集的标记，并且可以获取更详细的图像，尤其是在更高分辨率下。
未经修饰的鬼笔环肽不会渗透细胞膜，因此在活细胞实验中效率较低。 已经合成了鬼笔环肽的衍生物，其细胞通透性大大提高。用鬼笔环肽处理的细胞具有多种毒性作用，并经常死亡。此外，重要的是要注意，用鬼笔环肽处理的细胞与其质膜相关的肌动蛋白水平更高，而将鬼笔环肽微注射入活细胞将改变肌动蛋白的分布以及细胞运动性。
0.1mg鬼笔环肽溶于1ml无水甲醇（也可用DMSO或无水乙醇溶解）配成贮存液，可在-20度避光的条件下长期保存，工作液的浓度为5ug/ml，由贮存液加生理盐水PBS稀释20倍即可。