性格刚勇且不失温和，曾与父亲一色义道一起抗击织田信长部下细川藤孝对丹后的侵攻。1579年一色义道自杀后，义定继承了一色家的家督之位，率领弓木城的残党与织田军继续战斗。后来在细川藤孝、明智光秀的斡旋下，通过政略结婚，一色与细川氏达成和解，分割统治丹后。

天正十年，山崎一役后掌握了天下的丰臣秀吉接到了义定企图谋反的报告，于是令南丹后的细川氏将其暗杀，之后藤孝在宫津城的细川宅中暗杀了投降的一色义定，当初投降时一色义定是以迎娶细川藤孝的女儿为条件和解，因此他万万没想到藤孝会杀害已是女婿的自己。义定在宫津被杀的消息传开，丹波吉原城主一色义定的叔父义清成为弓木城城主并继任家督，但是藤孝已先发一步命细川忠兴包围弓木城，而细川兴元则包围了吉原城，最後义清亲自杀入细川军本阵，於下宫津战死，室町幕府四职家之一的一色家宣告灭亡，义定之妻伊也也回到了细川家，藤孝完全平定了丹后。