与此同时，沙俄军队从塞米巴拉金斯克向南进，1847 年，沿爱古斯河南侵，偷偷在巴尔喀什湖东南中国境内勒布什河和库克乌苏河之间建立科帕尔城堡。1851年起俄国乘清政府内外交困，阿勒坦山(阿尔泰山)地区秩序混乱之机，侵入鄂布河(鄂毕河)上游察那斯河(恰雷什河)、哈屯河(卡通河)、比亚河一带，并逐步向阿尔泰腹地、额尔齐斯河上游推进，想把中国的内湖斋桑泊据为己有，由于清政府采取了有力的防范措施，才使俄国侵吞斋桑湖的计划没有实现。但在1852年沙俄在中国图古勒池（今哈萨克斯坦阿拉湖）以北的雅尔地区建立了乌尔扎尔移民村，1854年夏占领了天山北麓吹河(楚河)与伊犁河之间的古尔班阿里玛图（长期作为哈萨克斯坦首都的阿拉木图），在古尔班阿里玛图附近建立了维尔内（维尔诺）城堡。同年10月，将科帕尔堡和维尔内堡划入新建的隶属于西西伯利亚的塞米巴拉金斯克省，擅自将中国巴尔喀什湖（当时为中国第一大湖）以东以南的地区划入俄国的版图，并继续向东将其势力扩张到特穆尔图淖尔(今伊塞克湖当时为中国第二大湖)一带。1856年把维尔内堡作为新成立的阿拉塔夫州首府，形成另一条包抄哈萨克草原，进攻中亚诸汗国的碉堡线，即当时大部分位于中国境内的西伯利亚线。

克里米亚战争后，双头鹰俄国为了挽回在欧洲一头的惨败，加紧侵略东方。1858～1859年，沙皇政府派遣 3个使团分赴中国喀什噶尔、呼罗珊、希瓦和布哈拉，收集情报，标志它在中亚的扩张政策进入新的阶段。3个使团中领导希瓦和布哈拉使团的是狂热的侵略分子、27岁的少壮派军人伊格纳切夫（尼古拉·帕夫洛维奇·伊格那季耶夫），回国后被派往北京任驻华公使后签定了为俄国在中亚东部边界的确定埋下伏笔的《中俄北京条约》。

1859～1863年间，俄国侵略军在锡尔河流域和楚河流域一带进行频繁的军事“侦察”，攻占和破坏浩罕边境的堡垒，不断缩短锡尔河碉堡线和西伯利亚碉堡线之间500多公里的缺口。1860年齐麦尔曼上校率领2000人从维尔内堡出发，于8月26日攻占了托克马克（附近就是著名的碎叶），9月4日攻占了皮什佩克（比什凯克今吉尔吉斯共和国首都苏联时期的伏龙芝）。

1861年沙皇亚历山大二世进行了俄国农奴制改革。资产阶级要求开拓商品输出市场和原材料供应市场的呼声一浪高过一浪。俄军在1863年完成了对高加索的军事征服，镇压了波兰1863年起义，深入中亚的条件已经成熟。1863年12月20日，亚历山大二世发布了联接东西碉堡线以便深入中亚的动员令。1864年夏，切尔尼亚耶夫上校率领2500人从维尔内堡出发，于6月16日攻占奥列·阿塔要塞。另一方面，维列夫金上校率领1200人从彼得罗夫斯克出发，于6月25日攻占伊斯兰教在中亚的圣城土耳其斯坦（突厥斯坦）。为了实现联接碉堡线的计划，7月底，沙皇政府决定建立“新浩罕线”，该线由楚河到锡尔河的阳尼·库尔干的全部堡垒组成，新晋升少将的切尔尼亚耶夫任司令。切尔尼亚耶夫立即进攻浩罕的军事和商业重镇奇姆肯特，被浩罕汗国的摄政大毛拉阿利姆库里（艾力木库尔汗）击退。但他在这年10月初乘阿利姆库里撤离之机攻陷该城，从而实现了锡尔河碉堡线和西伯利亚碉堡线的联接，并且继续向南推进，企图一举夺下有10万人口的中亚最大城市塔什干（今乌兹别克斯坦首都），未能得逞。同年10月7日，俄国和清政府在塔城签定了《中俄勘分西北界约记》，俄国取得了44万平方公里的新领土，基本确定了俄属中亚的东部边界。为了“安抚”英国等西方国家，俄国外交大臣亚历山大·米哈伊洛维奇·戈尔恰科夫（哥尔查科夫或者翻译为戈尔什科夫）公爵于1864年11月21日发出《戈尔察科夫通告》，竭力为俄国在中亚的侵略活动辩护，诡称奇姆肯特是俄军向南推进的“地理极限。”

不到半年，俄军再次发动进攻。当时的奥伦堡总督克雷扎诺夫斯基想亲自到前线指挥，但切尔尼亚耶夫为了争功抢先率领2000俄军和12门大炮对塔什干发动猛攻。1865年4月22日夺取了控制塔什干的咽喉要地尼阿兹别克堡，切断了塔什干居民的粮道。俄军把塔什干供水的两条渠道引开，切断了塔什干居民的水源。1865年 5月，浩罕抗俄势力的统帅阿利姆库里不幸阵亡。 6月28日，经过激烈的巷战后，塔什干沦陷。由于战术失误，武器落后30000守军竟然挡不住1950人的进攻，这次战役使沙俄在中亚的影响力大增。奥伦堡总督克雷扎诺夫斯基明确指示要把浩罕的新汗胡德亚尔汗当做俄国藩臣对待。并说“如果他感到委屈，那就更好办了，这给了我们彻底解决他的借口。”

1865年发生的另一大事件是阿利姆库里的政敌浩罕阿古柏伯克的扶持下，大和卓的曾孙布素鲁克在中国新疆建立的所谓的“哲德沙尔汗国”，俄国为了谋取在新疆的利益当年就承认了“哲德沙尔汗国”。此后俄国侵略军的矛头转向布哈拉汗国，沙俄不断挑拨各汗国之间的关系，历史上有着世仇关系的浩罕汗国与布哈拉汗国的对抗加剧了，当时在位布哈拉埃米尔穆扎法尔丁曾几次大举进攻浩罕，从而大大削弱了布哈拉汗国和浩罕汗国抵抗俄国侵略的力量。接着克列扎诺夫斯基向布哈拉汗国提出在10天内交出不可能筹集到的巨额贡款，布哈拉汗国无力交出，俄军就按原定计划发起了进攻。在1866年 5月20日伊尔贾尔的战役中打败埃米尔穆扎法尔丁的军队，然后占领霍占特、乌拉·丘别、吉扎克等城，控制了布哈拉与浩罕的联系通道。1867年7月11日成立了以塔什干为中心的土耳其斯坦总督区（土尔克斯坦总督区），由俄国陆军大臣办公厅主任，曾经担任俄占波兰的总督，号称“半沙皇”的康斯坦丁·彼得洛维奇·考夫曼任总督，从而开始了对中亚诸国征服的决定性阶段。

考夫曼先迫使精疲力竭的浩罕汗国胡德亚尔汗于1868年 2月签署不平等的“通商条约”，浩罕实际上变成俄国的附庸。接着全力对付布哈拉汗国，于1868年 5月派3500人占领了撒马尔罕和卡塔-库尔干。1868年6月14日，在卡塔－库尔干与布哈拉之间的吉拉布拉克高地的决战中，武器装备占有很大优势的俄军再次击败21000人的布哈拉埃米尔的军队，其中穆扎法尔丁精锐的6000御林军死伤大半，穆扎法尔丁投降。根据7月5日的和约，布哈拉承认霍占特、乌拉·丘别和吉扎克并入俄国，割让撒马尔罕和卡塔-库尔干，赔款50万卢布。布哈拉沦为俄国附庸。

然后是希瓦汗国。1869年，沙皇政府在里海东南岸的红水湾建立克拉斯诺沃斯克（克拉斯诺沃茨克），作为从里海东南岸进攻希瓦和土库曼的基地。而且并不放松对中国新疆的继续入侵， 1870年，俄国派使者前往喀什会晤阿古柏，承认其政权“洪福汗国”。但是当时阿古柏倾向于英国的支持，由于对阿古柏政权的控制不够，为防止英国在中亚的势力不断增强，沙皇政府捍然决定派兵入侵中国新疆的伊犁地区。借口就是把不堪受沙俄压迫奴役迁徙到中国境内的哈萨克人的一支阿勒班部落称为“逃犯”追剿。1871年5月根据亚历山大二世御前会议做出的决定，考夫曼下令七河省省长科尔帕科夫斯基率2000俄军和13门大炮去夺取中国的伊犁。科尔帕科夫斯基公开叫嚣要占领塔尔巴哈台、伊犁和喀什噶尔，并在此移民。新疆各族人民在武器落后，补养不足的情况下拼死抵抗，给侵略者以深重打击，沙俄侵略军猛攻50天才在7月4日攻占了伊犁。

1872年亚历山大二世向考夫曼下了一道臭名昭著的命令“康斯坦丁·彼得洛维奇，去把希瓦拿来吧”。沙皇政府作出了彻底征服希瓦汗国的决定。1873年2月沙俄侵略军在考夫曼统率下从土耳其斯坦、克拉斯诺沃斯克、曼格什拉克、奥伦堡分四路对希瓦发动强大攻势，6月占领希瓦城。7～ 8月间，考夫曼下令对附近的和平居民土库曼约穆德人进行了灭绝人性的屠杀。 8月24日签订俄希和约，希瓦汗国割让阿姆河右岸的全部土地,赔款 220万卢布，穆罕默德·拉希姆·巴哈杜尔汗成为“全俄皇帝的卑顺奴仆”。

1875～ 1876 年，浩罕爆发了民族大起义，浩罕、纳曼干、安集延和马尔吉兰等地人民对沙俄侵略者发动了“圣战”。沙俄军队在斯科别列夫率领下对这次起义进行了血腥镇压，俄军血袭了整个费尔干纳盆地，仅在安集延一地，斯科别列夫指挥俄军用大炮猛轰，安集延城基本被轰平，2万多起义者被埋葬在废墟下。1876年2月7日斯科别列夫指挥俄军占领了浩罕城，3月2日沙皇俄国正式宣布吞并浩罕汗国，改为由斯科别列夫为省长的费尔干纳省（浩罕末代纳斯尔丁汗被送到俄国弗拉基米尔斯克省软禁，他每年领取俄国政府发给的5000卢布的养老金），从而完成了对中亚三大汗国的征服。其中布哈拉和希瓦两个汗国名义上还被保留（到十月革命后的1920年才正式取消称号），实际上完全成了任沙俄摆布的奴仆。就在这一年斯科别列夫还组织了阿赖远征军，越过了阿赖岭，占领了吉尔吉斯（柯尔克孜）额德克纳的领地阿赖谷，为进一步侵占中国领土帕米尔高原打开了通道。

从1877年起，俄国对土库曼地区发动了全面进攻，同时俄国对与中亚国家有着千丝万缕联系的土耳其奥斯曼帝国发动了大规模战争。（中亚一些汗国的统治者被当时最强大的伊斯兰国家奥斯曼帝国哈里发封为埃米尔）在土库曼1879年 9月，俄军在攻打阿哈尔·捷金绿洲的重镇格奥克·帖佩时，遭到英勇的土库曼人的沉重打击狼狈窜回。1880年2月，亚历山大二世召开御前会议，决定必须征服土库曼全境，并指出：“不得后退一步，因为这对于欧洲和亚洲都会成为我们软弱的表示，而且可能使俄国所受损失比全部远征都大得无法估量。” 沙俄抢修了从里海东岸到阿哈尔·捷金绿洲的军用铁路，并征用了20000头骆驼，使俄军能得到大批装备和给养。1880年底，镇压浩罕起义的刽子手斯科别列夫率领11000人的大军带着97门大炮再度大举入侵土库曼，土库曼人在武器落后，工事简陋的情况下殊死抵抗，在俄军重炮连续轰击下，坚持了3个星期。俄军死伤1200多人才在1881年1月12日攻占了格奥克·帖佩。俄军不分男女老幼，又疯狂残杀了没有来得及撤离的8000名土库曼帖克人（格奥克捷佩堡战役）。接着俄军继续进攻占领了阿什哈巴德（今土库曼斯坦首都）。俄军掠走了大批阿哈尔·捷金纯种马（中国称为汗血宝马）作为俄国军马。1884年初，俄军攻占了通往伊朗和阿富汗的枢纽，土库曼人的最后一座重要城镇梅尔夫城（谋夫城）。俄军从梅尔夫城沿着穆尔加布河和库什卡河继续向南推进到阿富汗边境的库什卡河谷。由于库什卡离被称为里海、阿姆河、印度河之间的战略要地英国控制的赫拉特仅70英里，英俄矛盾极度紧张，战争一触即发。两国经过激烈谈判，1885年9月10日在圣彼得堡签定协议，俄国完全占有土库曼斯坦，彭狄绿洲直至库什卡河谷属英国势力范围的一些地区划归俄国，库什卡成为俄罗斯帝国和后来的苏维埃社会主义共和国联盟领土的最南端。

在最后完成对中亚诸国的征服时俄国加紧了对中国新疆的侵略，1881年签订了《中俄伊犁条约》，虽然收回了伊犁，但割去伊犁西部霍尔果斯以西的大片中国领土。以后又陆续迫使清政府签订了《伊犁界约》(1882年)、《喀什噶尔界约》(1882年)、《科塔界约》(1883年)、《塔尔巴哈台西南界约》(1883年)、《续勘喀什噶尔界约》(1884年)等5个勘界议定书，又强行割占了中国斋桑泊东南、霍尔果斯河以西、特穆尔图淖尔东南、阿克赛河源、阿赖山区等共7万多平方公里的土地。在1892年强占帕米尔萨雷阔勒岭以西2万多平方公里的中国领土，1895年和英国在伦敦举行会议，私自瓜分了帕米尔高原，塔吉克斯坦全归了俄国。从而实现了对中亚地区390万平方公里的征服。