（4）并非所有的tRNA氨基酸柄上的G3·U70都是它的副密码子。

用改变碱基的方法研究其他tRNA的副密码子，结果不但在氨基酸柄和反密码子环上、而且在D环和TyC环上也找到“副密码子”；而且对应于同一AARS来说，有好几处“副密码子”。所以把“副密码子”的那些碱基，改称为AARS的认同要素(identity element)。

用化学法将E. coli的tRNAfMet约一半碱基改变，表明氨基酸柄、D柄环和TyC柄环的碱基改变，都可导致fMetRS使此tRNAfMet氨酰化的能力降低；而反密码子环上C34、A35的改变，则完全不能被fMetRS氨酰化；说明tRNAfMet的反密码子对fMetRS的识别起主要作用。

采用片段移植法将某种tRNA的某一片段移植到另一种tRNA上，然后测定其应接的氨酰基，结果表明在20种同功tRNA中，有17种的识别要素(recognition element)是在反密码子上。

将各种tRNA的反密码子改造成为抑制琥珀型无义突变(amber suppressor)的反密码子(5’CUA3’)，又将二氢叶酸还原酶（DHFR）基因的10位密码子改造成为UAG，然后进行蛋白质合成实验，测定DHFR的10位氨基酸残基。其结果与片段移值法的结果基本一致，即反密码子对AARS的识别起重要作用。

将tRNAfMet的反密码子改造成为其他各种tRNA的反密码子，进行翻译实验，测定第1位氨基酸残基，结果仍然证明反密码子对AARS的识别起重要作用。

同一种AARS识别要素往往是有几处，但各处碱基的作用有主次之分。例如氨基酸柄、73位和反密码子，对于MetRS、AspRS、GlyRS的识别都起作用，但以反密码子为主。

tRNA除了为相应的AARS提供认同的正控要素外，还要为其他AARS提供排斥的反控要素；tRNAAsnGUU的认同要素只是反密码子上的单一核苷酸；如果将tRNAAsnGUU的反密码子GUU改造成为tRNALys的反密码子UUU，则不是被AsnRS认同，而是被LysRS认同，结果生成Lys-tRNAAsnGUU。

tRNA分子上出现多处AARS识别要素的原因在于AARS的不同。AARS按其亚基结构可以分为a1、a2、a4和（ab）4等多种。多肽链长短相差很大，从嗜热脂肪芽抱杆菌（Bacillus stearothermophilis）TrpRS的329aa，到E. coli ValRS的951aa。MW从59kDa~380kDa。

关于AARS识别tRNA上识别要素的机制问题，因AARS高分辨率空间结构分析的数据很少而不明确。GlnRS的Asp235对识别至关重要。

Normonly等人试验

上世纪70年代初，发现tRNATyr琥珀抑制在氨基酸接受柄上的突变能使tRNATyr错误地携带Glu。1984年，Prather等发现突变的tRNALys不仅保留对Lys的特异性，而且也能携带Ala或Gly。这个突变的错义抑制tRNALys是在氨基酸接受柄螺旋区的G3·C70被G3·U70碱基对所取代。

Normanly等的实验显示，取代tRNALeu中的12个碱基(无反密码子碱基的取代)，能够使tRNALeu转变为丝氨酸的tRNA。琥珀型抑制性tRNACys、tRNAPhe和tRNAAla，其反密码子均是CUA，而它们却携带不同的氨基酸。实验证明tRNA氨基酸接受臂上的G3·U70是tRNAAla独有的。对tRNAAla的36个非保守碱基作28种定点突变(包括反密码子改变)，只要保持G3·U70不变，仍能接受Ala；tRNAAla和tRNACys的G3·U70突变体，都能接受Ala甚至把tRNAAla的A9至C48或A14至U55缺失，只剩留有G3·U70的微型tRNAAla，仍能接受Ala；若把G3·U70改变，则不再接受A1a。将G3·U70引入tRNACys或tRNAPhe，亦可予二者携带Ala的功能。

tRNA氨基酸柄的3’CCA末端携带相应的氨基酸的作用是通过氨酰tRNA合成酶（AARS）完成的。AARS在密码翻译过程中十分重要。tRNA识别氨基酸的能力，是由AARS赋予的。反密码子在决定tRNA的特异性并非是唯一的关键。如tRNAAla的氨基酸柄上的G3·U70似乎是tRNAAla的副密码子，参与同AARS的作用。

侯雅明和Schimmel试验

1988年Hou Ya-ming（候雅明）和Schimmel首先取得了这方面的突破。他们采用的方法是：选用发生色氨酸琥珀突变(UGG→UAG)的营养缺陷型E.coli (trp)来进行研究；这种突变型必须在加有色氨酸的培养基上才能生长。当用含有校正tRNA，它携带着Ala，但反密码子突变成CUA，因此可以和终止密码子UAG相配对，这样校正了色氨酸的琥珀突变，在色氨酸突变位点加入了Ala 。转化E.coli后只要校正率达到3%，该trp菌株就可在普通培养基上生长。然后他们用点突变的方法来改变校正tRNA（Ala）上的各个位点，观察对识别Ala有何影响，以此来确定与识别特异氨基酸的有关位点。他们获得了28个突变株。分别转化E.coli (trp)，再检测转化后的E.coli (trp)在基本培养基上是否能生长。若仍能生长，说明相应的点突变位点和氨基酸的识别无关，若不能生长说明相应的点突变位点与tRNA的“身份”有关。

他们用上述方法证明了Ala tRNA的G3:U70碱基对，仅一对碱基决定了丙氨酰tRNA合成酶与tRNA的识别，他们就把这样很小的元件称之为tRNA的“identity”，或称为副密码子（paracodon）。已知的tRNA的“身份”如表14-5所示。

Schimmel , Hou ya-ming和施建平等用合成的微螺旋做氨基酸接受试验，证明只要具有Ala tRNA受体臂那样长的微螺旋，或者具有该tRNA受体臂和TψC茎连在一起的小螺旋，且在受体臂有相当于G3-U70的碱基对，它们就能接受Ala，已发现带有了三种不同反密码子（CUA, GGC, UGC）的Ala tRNA都具有G3-U70副密码子。

表14-5表明这些位置的共同特点是：

（1）关键位点的数很少（1~5）个；

（2）副密码子较集中在反密码子和受体臂上，此与tRNA的L型三维结构和氨基酰-tRNA聚合酶结合的空间构型有关；

（3）由于一个碱基对不能足以使20套tRNA被普遍的识别，因此不同的tRNA都有自己特殊的规律来进行识别。

氨基酸-tRNA是由氨基酸-tRNA合成酶催化产生的。这种酶需要三种底物即氨基酸,tRNA和ATP。ATP提供了活化氨基酸所需要的能量。氨基酸首先活化成氨基酸腺苷酸(这一中间产物与酶相结合),然后再与tRNA生成氨基酸-tRNA：

aa +ATP ←→aa-ADP + ppi

aa-ADP +　tRNA ←→aa-tRNA + ADP

总反应：　aa + tRNA + ADP ←→aa-tRNA + ADP + ppi

细胞内有20种氨基酸,有40种以上的tRNA,氨基酸tRNA合成酶是如何选择正确的氨基酸和tRNA的呢? 人们至今尚未弄清其详细作用机制。按照一般原理,酶和底物的正确结合是由二者相嵌的几何形状所决定的。只有适合的氨基酸和适合的tRNA进入合成酶的相应位点,才能合成正确的氨酰基-tRNA。已经知道合成酶与L形tRNA的内侧面结合,结合点包括接受臂,DHU臂和反密码子臂。在这几个位点上的tRNA突变则妨碍正确的氨基酸接载。

乍看起来,反密码子似乎应该与氨基酸的正确荷载有关,对于某些tRNA也确实如此。然而对于大多数tRNA来说,情况并非如此。人们早就知道,来源于少数tRNA的抑制tRNA,尽管它们的反密码子已经改变(识别无义密码子),但它们携带氨基酸的性质并没有改变。1986年,Normanly等人将亮氨酸tRNA分子中置换了12个核苷酸(反密码子未动),则变成了携带丝氨酸的tRNA。1988年,侯雅明和Schimmel做了十分出色的试验:将丙氨酸抑制tRNA(tRNAAla/CUA)分子突变了许多位点,组成了28种突变体(14种在接受臂上)。结果发现,许多突变体都不改变接载丙氨酸的性质,而只有改变G3:U70这一碱基对的突变体才表现出明显的突变效应(不能抑制trpA基因中第234个amber无义突变)。另外两种amber抑制tRNA(tRNACys/CUA,tRNAPhe/CUA)虽然对于trpA基因中的无义突变能够抑制,但都不能恢复TrpA+表现型,因为半脱氨酸或苯丙氨酸的插人都不能形成有活性的α亚基。尽管这两个抑制tRNA分别有38个和31个核苷酸不同于tRNAAla/CUA,但是如果将它们的C3:U70改变为G3:U70,均能为丙氨酸tRNA合成酶所识别。这就说明,G3:U70是丙氨酸tRNA分子决定其本质(携带丙氨酸)的主要因素。

由上所述,可以看出,一种氨基酸tRNA合成酶可以识别一组同功tRNA(最多达6个),这说明它们具有共同特征。例如丙氨酸tRNA合成酶识别G3:U70,在已发现的三种丙氨酸tRNA(tRNAAla/CUA,tRNAAla/GGC,tRNAAla/UGC)都具有G3:U70副密码子。但还没有充足的证据说明其他氨酰基tRNA合成酶在其同功tRNA组中也是识别相同的副密码子。其次,副密码子并没有固定的位置,亦可能并不止一个碱基对。例如上述的tRNACys/CUA和tRNAPhe/CUA都具有C3:G70,显然它们的副密码子不在C3:G70或者不完全在C3:G70,因为它们携带两种不同的氨基酸。第三,尽管副密子不是单独与氨基酸发生作用,但是副密码子可能与氨基酸的侧链基团有某种相应性。tRNA分子对错误接载的氨基酸具有校对功能,可能就是来源于这种相应性。副密码子可能是从立体化学寡聚核苷酸。这种识别氨基酸的特异性在某种程度上保留下来,而反密码子是在tRNA分子进化过程中后来才出现的。这就是说,副密码子比密码子和反密码子更为古老。

关于氨基酸-tRNA合成酶和tRNA参与校对的分子细节还不清楚。该系统可以通过多级的校对功能排除错误的接载。其中主要有动力学校对(Kinetic proofreading),构象校对(conformational proofreading)和化学校对(chemical proofreading)。动力学校对是基于合成酶对于错误氨基酸形状的识别,即使生成氨基酸腺苷酸形式,也会将它水解。构象校对是在氨酰基腺苷酸生成以后,由于tRNA的进入引起酶构象的改变,使得已生成的氨酰基腺苷酸不符合进一步连接成氨基酸-tRNA的要求,从而水解之。化学校对是指错误的氨基酸已接载到tRNA上之后,被合成酶的tRNA结合位点所发现,然后水解之。虽然说不少人倾向于最后一步机制,但都缺少令人信服的证据。

破译副密码子的意义不仅仅限于tRNA分子本身生物学功能的认识，更重要的是将对生物化学，生物起源，分子生物学及遗传学产生重大影响。

tRNA的结构

1.tRNA结构保守：70-80个碱基。

2.二级结构：三叶草。

3.五个主要臂：(1)接受臂：携带氨基酸；(2)TΨC臂；(3)反密码子臂；(4)双氢尿嘧啶臂（DHU）；

(5)附加臂：大小反映了整个tRNA分子的大小，根据其大小，tRNA分为两类：第Ⅰ类tRNA，3/4 tRNA只有3-5个碱基的附加臂；第Ⅱ类tRNA，其余含有13-21碱基的附加臂。

4.三级结构：倒L形

(1)所有的tRNA分子均具有L形状，采取A构象；

(2)接受臂上存在G·U配对；

(3)三维结构靠氢键堆积力；

(4)所有的tRNA具有同样得空间结构。

(5)接受臂、反密码子臂位于双螺旋的两端；

(6)TΨC臂位于L的两臂交间处；

(7)维持空间结构的力是氢键和碱基堆积力。

密码子与反密码子

1.密码子：DNA或mRNA的四种碱基共组成64个三联体密码子。

2.终止密码子：又称无义密码子，指3个肽链终止密码，不编码氨基酸。

3.携带稀有氨基酸的tRNA也能识别终止密码子。

4.简并密码：由多种密码子编码一个氨基酸的现象。

5.摇摆性：(1)定义：指一种反密码子能够与不同的密码子发生碱基配对；

(2)决定因素：摇摆性取决于反密码子噗噜空间结构。tRNA空间结构中，相邻碱基存在着堆集力，反密码子5′端的一个碱基处在堆集碱基的末端，所受堆集力小，自由度较大，而且常为修饰过的碱基，无A和U，A修饰为I（次黄），与U、C、A配对。

6.同功tRNA：携带AA相同而反密码子不同的一组tRNA，一组同功tRNA由同一种氨酰基-tRNA合成酶催化而携带氨基酸。

7.有时拥有相同反密码子的tRNA有好几种，它们的结构有很大的差异，有不同的基因编码。

tRNA对氨基酸的识别

tRNA通过反密码子和mRNA上的密码子相互配对，将特定的氨基酸运送到核糖体上肽链合成位点上，但是tRNA如何来识别特定的氨基酸呢？这就涉及tRNA的“身份”（identity）问题，这个问题是核酸领域的热点之一。人们需要解决几个问题：（1）tRNA怎样接受特定的氨基酸，氨基酰－tRNA合成酶怎样识别tRNA；（2）tRNA中的哪些结构和接受特定氨基酸有关。