更新时间：2024-01-18 23:12
利用DNA聚合酶合成与模板互补的DNA链， 在三维空间中记录模板位置和核苷酸序列信息， 再反向构建DNA模板的序列。除了DNA合成反应的三大要素（模板、酶、核苷酸）之外， 模板所处位置和反应循环中单色荧光标记的核苷酸顺序(如A、C、G、T )也是最终DNA序列能够完成的关键要素。如果反应所用的核苷酸标记着四种不同的荧光， 则每一次反应循环就需要切换不同波长的光以记录不同的碱基。
本文主要介绍单分子测序平台。
Helicos Biosciences 是第一个设计开发单分子测序方法( tSMSTM) 技术平台的公司，其基础主要来自于Braslavsky 等人的研究。主要是利用合成测序理论，测序时首先将待测序列打断成小片段并在3'末端加上polyA ，并用末端转移酶阻断，同时在玻璃芯片上随机固定多个polyT引物( 其末端皆带有荧光标记) ，将小片段DNA 模板与检测芯片上的polyT 引物进行杂交并精确定位，通过成像来精确定位杂交模板所处的位置，建立边合成边测序的位点; 逐一加入荧光标记的单色末端终止子及聚合酶的混合液孵育，洗涤，利用全内反射显微镜( total internal reflection microscopy，TIRM)进行单色成像，之后切开荧光染料和抑制基团，洗涤，加帽，允许下一个核苷酸的掺入。通过掺入、检测和切除的反复循环，就可以实现实时测序。由于该技术采用了Cy5 ( 吲哚-5-菁) 荧光基团具有很好的光稳定性、高水溶性和高荧光效率，激发波长在647nm 处和灵敏的监测系统，能够直接记录到单个碱基的荧光，从而克服了其他方法须同时测数千个相同基因片段以增加信号亮度的缺陷。
SMRT 技术是基于边合成边测序的思想，以SMRT芯片为载体进行测序反应。SMRT芯片是一种带有很多零模式波导孔( zero-mode waveguides，ZMW) ( 厚度为100 nm) 的金属片，ZMW 是一种直径只有几十个纳米的孔，由于其底部上的小孔短于激光的单个波长，导致激光无法直接穿过小孔，而会在小孔处发生光的衍射，形成局部发光的区域，即为荧光信号检测区，该区域内锚定有DNA 聚合酶。测序时将基因组的DNA打断成许多小的片段，制成液滴后将其分散到不同的ZMW 纳米孔中。当ZMW 孔底部聚合反应发生时，被不同荧光标记的核苷酸会在小孔的荧光探测区域中被聚合酶滞留数十毫秒，荧光标记会在激光束( Excitation) 的激发下发出荧光，根据荧光的种类就可以判定dNTP 的种类，反应完成后荧光标记会被聚合酶切除而弥散出ZMW 小孔，其它未参与合成的dNTP由于没进入荧光信号检测区而不进入荧光信号检测区。SMRT 测序时，样品准备过程涉及到样品DNA 的打断、末端补齐、连接接头、测序这几个步骤。测序中需要的样品量很少，样品准备中所用的试剂也很少，而且测序过程中省去扫描和洗涤的过程，所以测序所花的时间较少。
纳米孔单分子技术
Oxford Nanopore Technologies 公司研发的测序技术完全不同于前两种测序技术，其核心就是将在某一面上含有一对电极的特殊的脂质双分子层置于一个微孔之上，该双分子层中含有很多由α溶血素蛋白组成的纳米孔中结合一个核酸外切酶。当DNA 模板进入孔道时，孔道中的核酸外切酶会“抓住”DNA 分子，顺序剪切掉穿过纳米孔道的DNA碱基，每一个碱基通过纳米孔时都会产生一个阻断，根据阻断电流的变化就能检测出相应碱基的种类，最终得出DNA 分子的序列。纳米孔单分子测序技术的一大优势就是仪器构造简单使用成本低廉; 因为它不需要对核苷酸进行标记，也不需要复杂的光学探测系统( 如激光发射器和CCD信号采集系统等) ，能直接对RNA 分子进行测序。同时由于它是直接检测每一个碱基的特征性电流，因而能对修饰过的碱基进行测序，这一点对于表观遗传学研究具有极高的价值; 缺点就是它采用的是水解测序法，不能进行重复测序，因而无法达到一个满意的测序精确度。
由于单分子测序具有通量更高，仪器和试剂相对便宜、操作简单等的优势而比第二代测序技术有更广阔的应用空间。
基因组测序
由于具有读长长的特点，SMRT 测序平台在基因组测序中能降低测序后的Contig 数量，明显减少后续的基因组拼接和注释的工作量，节省大量的时间。Christophern 等仅仅用0． 5 × 的PacBio RS 系统长度的数据与38 × 的二代测序( NGS) 的测序数据，对马达加斯加的一种指猴基因组进行拼装，大幅度提高了数据的质量和完整度，同时借助Pacbio RS 的帮助将原有的Contig 数量减少了10 倍。David A． 等利用PacBioRS 平台和C2 试剂通过全球合作几天内就完成了从德国大肠杆菌疫情中获得的大肠杆菌样品以及近似菌株的测序和数据分析，最终获得了2 900bp 的平均读长以及99． 998% 的一致性准确度。在对霍乱病菌的研究中，第三代测序技术已初现锋芒。研究人员对5 株霍乱菌株的基因组进行了测序研究，并与其他23 株霍乱弧菌的基因组进行对比。结果发现海地霍乱菌株与2002 年和2008 年在孟加拉国分离得到的变异霍乱弧菌El Tor O1 菌株之间关系密切，而与1991 年拉丁美洲霍乱分离株的关系较远。相对NGS 的优势就是能更快获得结果，因此该系统在鉴定新的病原体和细菌的基因组测序方面得到很广泛的应用。
甲基化研究
SMRT 技术采用的是对DNA 聚合酶的工作状态进行实时监测的方法，聚合酶合成每一个碱基，都有一个时间段，而当模板碱基带有修饰时，聚合酶会慢下来，使带有修饰的碱基两个相邻的脉冲峰之间的距离和参考序列的距离之间的比值如果大于1，由此就可以推断这个位置有修饰。甲基化研究中关于5-mC 和5-hmC( 5-mC 的羟基化形式) 是甲基化研究中的热点。但现有的测序方法无法区分5-mC 和5-hmC。美国芝加哥大学利用SMRT 测序技术和5-hmC 的选择性化学标记方法来高通量检测5-hmC。通过聚合酶动力学提供的信息，可直接检测到DNA 甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC 和5-hmC，为表观遗传学研究打开了一条通路。
突变鉴定( SNP 检测)
单分子测序的分辨率具有不可比拟的优势，而且没有PCR 扩增步骤，就没有扩增引入的碱基错误，该优势使其在特定序列的SNP 检测，稀有突变及其频率测定中大显身手。例如在医学研究中，对于FLT3 基因是否是急性髓细胞白血病( AML) 的有效治疗靶标一直存在质疑。研究人员用单分子测序分析耐药性患者基因，意外发现耐药性与FLT3 基因下游出现的稀有新突变有关，重新证明了FLT3 基因是这种最常见白血病—急性髓细胞白血病( AML) 的有效治疗靶标，打破了一直以来对于这一基因靶标的疑惑。凭借PacBio 平均3 000bp的读长，获得了更多基因下游的宝贵信息，而基于单核酸分子的测序能够检测到低频率( 低至1%) 罕见突变，正是这项成果的关键所在。