2003年，是地铁工程的决战之年，先后遭遇了突如其来的非典疫情、百年不遇的暴雨袭击和37年未遇的高温侵扰，地铁建设遇到了前所未有的严峻挑战；6月29日凌晨4时，指挥部接报，新街口至张府园地段，路面出现大面积沉降。指挥部领导立刻意识到这是重大险情的预兆——连日罕见的大暴雨，使联络通道竖井周围土体发生很大变动，如不立刻控制水势，不仅隧道封堵报废，更为严重的是将造成地面大面积塌方，建筑物垮塌，后果不堪设想。指挥部领导沉着应战，一方面命令立即向市政府报告，另一方面按预案实施紧急抢险。以最快的速度调集了几十车混凝土和几百吨散装水泥，整整3个小时，终于控制住了险情。——几天之后，媒体传来了外地地铁施工发生大面积塌方的重大事故，险情竟和南京的一模一样；7月1日，南京地铁1号线开始铺轨；12月31日，南京地铁运营分公司正式挂牌成立，标志着南京地铁运营工作的全面启动。

2004年6月26日，南京地铁1号线工程全线轨道贯通。后又陆续实现电通以及车辆上线热滑。

2005年5月15日上午9时，南京地铁1号线开通观光运营，南京成为继北京、天津、上海、广州、深圳之后，中国内地第6个拥有地铁的城市；历时两个半月，每逢双休日共计20天的观光运营，南京地铁共计开行514列次，运送旅客76612人次，累计行驶5928千米，运行图兑现率100%，列车正点率100%，达到了预期的目标，历时两个半月的观光运营圆满完成；观光运营圆满完成之后，南京地铁1号线又开始了模拟试运营，经过了11天的空载模拟运行；8月12日，南京地铁1号线开始模拟试运营，对开的首班车分别于6:28从小行站、6:30于迈皋桥站开出，首日试运营共投入6辆列车，全天开行156车次。模拟试运营受到了南京市民的热烈响应，平均每天10余万人次的客流量；一时间，地铁成了古都街谈巷议的话题，成了媒体报道的重点；8月16日，南京地铁1号线工程通过初步竣工验收；9月3日，南京地铁1号线正式开通运营；12月31日，《南京市城市快速轨道交通建设规划（2004-2015年）》上报国务院获批，南京地铁1号线南延线正式立项，也包含南京地铁1号线西延过江线（即南京地铁10号线过江段的雏形）。

2006年11月，南京地铁1号线一期鼓楼——玄武门区间隧道工程获第六届詹天佑土木工程大奖；11月20日，南京地铁1号线南延线试验段正式开工。

2007年3月14日，南京地铁1号线南延线工程可行性研究报告通过国家发改委审批。

2008年5月28日，南京地铁1号线一期工程通过竣工验收。

2010年1月10日，南京地铁3号线暨南京地铁1号线西延过江线试验段（即南京地铁10号线过江段）在南京南站举行开工典礼；安德门站至奥体中心站段已建成，是南京地铁1号线的一部分；5月6日，南京地铁发布招标文件中，将南京地铁1号线西延过江线改称南京地铁10号线，且对工程予以明确，加入了新建安德门站和小行站至奥体中心站改造工程；5月28日，南京地铁1号线南延线与南京地铁2号线建成通车，南京地铁1号线贯通以Y字分叉运营。

2011年6月28日，南京地铁1号线南延线南京南站开通。

2013年11月，南京地铁公司为1号线向南京浦镇城轨公司增购13列列车，总价5.89亿元。

2014年6月1日，原南京地铁1号线小行站至奥体中心站四个站点停运并入南京地铁10号线。

2015年5月，增购13列车的首列车开始上线运营。

2015年5月5日，《南京市城市轨道交通建设规划（2015—2020年）》获国家发改委批复，其中包括地铁1号线北延工程；6月15日，南京地铁1号线北延工程勘察、设计类项目招标咨询（DS7-XY01-01标）事务开始招标；11月5日，南京地铁1号线北延工程单项设计、地质勘察、设计总体-总包管理、勘察设计审查、岩土工程咨询等相关事务开始招标。

2016年1月27日，南京地铁1号线北延工程环境影响评价报告开始招标；4月6日，南京地铁1号线北延工程环境影响评价第一次公示；6月14日，南京地铁1号线北延工程环境影响评价第二次公示；7月20日，南京地铁1号线北延工程环境影响评价全本公示；8月初，南京地铁1号线北延工程可行性研究报告通过专家评审；9月22日，南京地铁1号线北延工程环境影响评价获得省环保厅批复；9月，南京地铁1号线北延工程节能评估报告书获得省发改委批复；12月30日，南京地铁1号线北延工程二桥公园站（现八卦洲大桥南站）完成一期围挡施工。

2017年1月17日，南京地铁1号线北延工程初步设计获得市发改委批复；5月，南京地铁1号线北延工程正式动工；9月起，南京地铁1号线北延工程陆续进行围挡施工。

2018年9月，南京地铁1号线北延工程二桥公园站（现八卦洲大桥南站）一期围护结构完工。

2019年7月31日上午，南京地铁1号线北延工程全线首台盾构在迈皋桥站～晓庄站区间左线始发。

2020年1月15日，南京市交通运输局发布《关于南京地铁5条线路车站站名的公告》，对68座车站的最终命名进行公示，其中包含1号线的5个车站；10月11日，南京地铁1号线北延八卦洲大桥南站主体结构封顶。

2021年7月29日，南京地铁1号线北延吉祥庵站主体结构封顶；8月31日，南京地铁1号线北延晓庄站主体结构全面封顶；10月31日，南京地铁1号线北延笆斗山站主体结构全面封顶；11月，南京地铁1号线北延线全面开展土建施工。

2022年5月27日15时10分，南京地铁1号线北延燕子矶站～笆斗山站区间右线盾构贯通。标志着1号线北延工程全线洞通；6月7日下午，南京地铁1号线北延工程高架区间段合龙；6月14日，南京地铁1号线北延工程晓庄站～燕子矶站一次性送电成功；6月25日上午，南京地铁1号线北延燕子矶站主体结构封顶；7月8日，南京地铁1号线北延工程全线短轨通；7月14日晚，南京地铁1号线北延工程全线长轨通；7月28日，南京地铁1号线北延笆斗山站～二桥公园停车场三个变电所一次性送电成功，标志着全线变电所送电成功；8月9日上午，南京地铁1号线北延工程冷滑试验圆满完成；8月12日，南京地铁1号线北延线开始电气化通讯设备割接施工；8月16日，南京地铁1号线北延工程完成热滑试验；8月16日，南京地铁1号线北延线完成割接施工；9月14日，南京地铁1号线北延线通过项目工程验收；9月16日，南京地铁1号线北延线开始不载客试运行；12月19日，南京地铁1号线北延线通过竣工验收；12月28日，南京地铁1号线北延线开通运营。

2023年9月29日至9月30日、10月4日至10月6日1号线延时运营至次日0:00，南京地铁1号线南京南站的末班车延时至次日1:00，延时期间行车间隔为10至20分钟。10月1日至10月3日线网各线路维持正常运营时间。

南京地铁1号线采用全线大交路的运行模式，大交路从八卦洲大桥南站到中国药科大学站，单趟运营时间为74分钟。

南京地铁1号线开通之初，日均客流约15万余人次。

2010年9月30日，南京地铁总体日客流量达到110万人次，南京地铁1号线（含南延线）日客流量74万人次，南京地铁2号线日客流量36万人次；其中，新街口、南京站、玄武门客流是南京地铁当天日客流量最大的三个站。

2014年4月30日，地铁1号线客流达108.96万人次，是在此之前的最高单日线路客运量。

2017年4月28日，地铁1号线客流达113万人次，是在此之前的最高单日线路客运量。

2018年9月30日，地铁1号线客流达115.36万人次，是在此之前的最高单日线路客运量。

2019年3月8日，地铁1号线客流达120.56万人次，是在此之前的最高单日线路客运量。

2019年12月31日，地铁1号线客流达121.2万人次，是在此之前的最高单日线路客运量。

2020年12月31日，南京地铁1号线再创新高，客流达124.7万人次，为最高单日线路客运量。

南京地铁1号线采用宽体A型地铁列车，行走制式为钢轮钢轨，轨距为1.435米，采用4动2拖方式编组，共配车35列210辆（截至2018年底）。每一列车有6节编组，每节长24.4米、宽3米、高3.8米，每节车厢每侧各5扇塞拉式车门，单节载客量310人，整列载客量1860人，最高运行时速80千米/时。车身颜色为蓝色主色调、白色裙边、黑色窗框勾边。

地铁1号线分为A、B、C三种型号，A车为带司机室的无动力拖车，B车为带受电弓的动车，C车为不带受电弓的动车，每一列地铁列车由两组A、B、C车组成，共编组成20列车。最大时速＞80千米，旅行时速＞35千米，采用直流1500V供电（隧道内为刚性接触网，高架和地面为柔性架空接触网）。

地铁1号线第一列列车由法国阿尔斯通在法国生产调试并运往南京，其余19列以及南京地铁1号线南延线新列车均由南京浦镇车辆公司生产；南京浦镇车辆厂和法国阿尔斯通公司合作生产的这种地铁车辆（第一列共6辆在法国生产，其余十九列共114辆在南京生产），是地铁车辆家族中载客量最大的一种，是世界上流行的一种，正被亚洲的新加坡等地采用。

南京地铁1号线共安装自动扶梯90台，残疾人电扶梯24部。为了方便残疾人，大多数车站都设有专供残疾人使用的垂直电梯。迈皋桥、三山街、南京站因特殊原因无法安装垂直电梯，就在楼梯一侧安装了轮椅升降台。

南京地铁1号线设置了先进的导向标识系统。这套系统由电子标识、语音提示系统以及分布各个角落的液晶显示系统等组成，乘客不用担心在地下宫殿迷失方向。

地铁车站内普遍不设固定的公共厕所，这是国际惯例。地铁车站不建厕所主要是出于安全的考虑。关于南京地铁要不要建公厕，省市领导很是关心，指挥部领导经过慎重考虑，并征得专家的同意，决定打破常规，在鼓楼站、新街口站、小行站（现为10号线）、中胜站（现为10号线）、元通站（现为10号线）各建了两座厕所，奥体中心站（现为10号线）则建了3座公厕。

充值网点：迈皋桥站、红山动物园站、南京站、玄武门站、张府园站、三山街站、中华门站、花神庙站、南京南站、双龙大道站、竹山路站（充值时间为：8:00-11:00；11:30-18:30）

综合业务点：新模范马路站、鼓楼站、珠江路站、新街口站、安德门站、河定桥站、百家湖站、龙眠大道站（服务时间为：8:00-11:30；12:00-17:30）

自助营业机：全线所有车站均有（服务时间为地铁站运营时间）

注：充值网点提供充值服务和购买充值卡服务；综合服务点提供充值、售卡、学生卡办理和年检、过期卡激活、记名卡挂失、市民卡开卡等业务。

南京地铁1号线建设初期困难重重，时任地铁指挥部指挥长的戴永宁副市长针对当时地铁建设的实际，归纳出五大难点：一是协调难度大，工程要穿过新街口、鼓楼、玄武门等中心区，不可避免地会遇到一系列的矛盾。二是地质条件劣，给施工带来了很大的难度。三是地下管线繁杂。四是交通组织难，一些地段要封闭施工，交通组织困难。五是人才资源缺，地铁建设在中国是一门新兴产业，专业人才奇缺。

首先要做的就是选拔人才。他们从做过地铁的城市引进一批；从专业技术人员中精选一批；从通讯、信号、自动化、车辆等专业优秀毕业生中选出一批；从其他重点建设工程调一批；从有实践经验、身体好的离退休专业人员中返聘一部分。这五方面的人才，成为地铁建设的精兵强将。

面对施工中给城市道路交通带来的影响，他们每个施工地点，都做到尽快恢复路面，方便市民出行，并采取措施限制特定时间和夜间施工，把对市民出行和生活的影响降低到最小程度。

南京的地质状况复杂，地下水位较高，有较多的古河道及大量含水砂层。同时，施工线路上原有的上下水、煤气、供电、通讯等管线交错其下，管线种类达到27种。指挥部邀请了地质勘探方面各个层次的专家学者，针对不同的情况制定不同的施工方案，并对可能发生的问题做好应急预案。

南京地铁1号线的艺术设计以南京的地域文化特色为主题，在主要车站设有主题文化墙，运用雕塑、壁画等多种艺术形式。

“糖果车站”缘起一个真实的感人故事：一对夫妻带着患病的孩子到南京市儿童医院治病后，乘地铁返回。在珠江路地铁站，患病的孩子哭着说想吃糖，囊中羞涩的父母很为难。一名地铁员工看到这一幕，从口袋中掏出为自己儿子准备的糖果，送到患病孩子的手中，并嘱咐孩子要听父母的话，早日康复。从那以后，珠江路地铁站的所有员工，都带着糖果上班。由此，拿到糖果的孩子们都亲切地把南京地铁珠江路站叫做“糖果车站”。

2008年6月，在珠江路糖果车站初步成功推出的基础上，南京地铁启动了第二个品牌车站的打造工程——新街口·和谐车站，是亚洲最大的地铁站。

地铁南京南站于2011年6月28日开通，该站站厅层有一面20多米长的“爱墙”，成为南京新符号。爱墙上，书写着4000多人对于爱的感悟，这在中国还是首创。“爱墙”设置在地铁南京南站地下一层的站厅，长21.6米，高3米，离地0.6米，用10厘米厚的白色大理石制成。征集来的“爱的箴言”，依照原字迹逐一铭刻在大理石上，从远处看，这些爱的字迹将构成六幅“爱的手势”。这一爱墙将作为地铁南京南站的标志性艺术品，永久性展示。在这面爱墙上，除了字体各异的中文外，还有很多外国友人的手迹，甚至还有盲文、少数民族文和英文。

“鼓楼·清风站”是继珠江路“糖果车站”、新街口“和谐车站”、南京南站“博爱车站”之后，南京地铁推出的又一人文品牌车站。之所以起名叫“清风”车站是因为这是地铁公司和南京市纪委联合打造一个廉政文化主题车站。鼓楼站地处北京东路和北京西路交接处，东西两侧聚集省市党委政府等一大批机关单位，“清风”则寓意“清风廉洁”，地铁站内布设公益广告、书画等廉洁文化作品，意在全社会营造崇尚廉洁的氛围。

地铁1号线南京站北站厅中“美德”的主题体现在站厅装饰的每个角落，带有祥云图案的天蓝色立柱上，印有“诚信、民主、法治、友善、公正、爱国”的社会主义核心价值观。站厅顶上共悬挂3列波纹状的宣传牌，中间一列介绍的是省内的美德模范，用双臂接住跳楼女生的最美宿管阿姨阮桂娇（第四届江苏省道德模范提名奖）便是其中一位。旁边两列悬挂的宣传牌上，则写有市民耳熟能详的美德箴言，如“民生在勤，勤则不匮”等，一直延续到出入口的通道内。

2016年3月1日下午，中国（南京）软件谷与南京地铁集团携手打造的中国首个“创业主题地铁车站”，在南京地铁软件大道站举行揭牌仪式。这是继珠江路糖果车站、新街口和谐车站、南京南站博爱车站、鼓楼·清风车站、南京站美德车站等之后，南京地铁推出的第六个主题车站。整个车站共分为：营造创业氛围，激发人才创造活力的氛围营造区；在站厅层和站台层均有分布的产品体验区；实时更新，集展示与宣传于一体的信息发布区；提供谷内众创空间和创投机构的资源对接区以及举办小型的创业活动的创业活动区五大功能板块。

2006年，由霍建华、林心如主演的电视剧《地下铁》在南京拍摄取景，片中地铁取景自南京地铁1号线。

南京地铁1号线的开通，使南京成为继北京、天津、上海、广州、深圳之后，中国内地第6个拥有地铁的城市。南京地铁1号线缓解南京日趋拥挤的城市交通，改变城市客运格局，在巩固新街口商圈功能地位的同时，提升夫子庙、湖南路等地区旅游景点的交通功能。

南京地铁1号线北延工程的建设有利于南京市整体交通结构的完善，有利于城市的改造、开发和发展，具有显著的社会效益、经济效益和环境效益。

2023年12月21日早间，据南京地铁报道，南京地铁1号线河定桥站突发信号故障，目前1号线改全线大交路运行。