口蹄疫病毒致病分子机制

FMDV可以与宿主细胞表面的受体分子结合, 通过胞吞作用进入细胞, 在细胞质内复制和增殖, 通常在感染4h~6h后可生成新的感染性病毒粒子。病毒感染的第一步是受体的特异性识别, 研究证实, 整联蛋白和硫酸乙酰肝素是FMDV的受体.体外实验表明, 整联蛋白αVβ1、αVβ3、αVβ5、αVβ6、αVβ8可以识别FMDV衣壳蛋白VP1的RGD基序, 其中αVβ6只存在于上皮细胞中, 相比于其他受体, 病毒在体内更易于与其结合。然而, 在FMDV自然感染过程中, 何种整联蛋白发挥关键作用及整联蛋白间的协同功能尚不清楚.硫酸乙酰肝素是体外培养时FMDV利用的受体, 最初被认为是某些O型FMDV进入细胞的受体, 后来发现A、C、Asia1和SAT-1等其他血清型病毒也能以硫酸乙酰肝素为细胞受体。.最新研究发现, Jumonji C-domain containing protein 6 (JMJD6) 为磷脂酰丝氨酸受体, 具有精氨酸脱甲基酶活性的同时, 可以作为FMDV的替代受体.Lawrence等研究证实, FMDV可以利用JMJD6在不表达整合素和硫酸乙酰肝素的CHO677细胞内增殖。

患口蹄疫的动物会出现发热、跛行和在皮肤与皮肤黏膜上出现泡状斑疹等症状。

病毒量以在病畜的内唇、舌面水泡或糜烂处，在蹄趾间、蹄上皮部水疱或烂斑处以及乳房处水泡最多；其次在流涎、乳汁、粪、尿及呼出的气体中也会有病毒排出。

恶性口蹄疫还会导致病畜心脏麻痹并迅速死亡。

人一旦受到口蹄疫病毒传染，经过2-18天的潜伏期后突然发病，表现为发烧，口腔干热，唇、齿龈、舌边、颊部、咽部潮红，出现水泡（手指尖、手掌、脚趾），同时伴有头痛、恶心、呕吐或腹泻。患者在数天后痊愈，愈后良好。但有时可并发心肌炎。患者对人基本无传染性，但可把病毒传染给牲畜，再度引起畜间口蹄疫流行。

病畜和带毒畜是主要的传染源，它们既能通过直接接触传染，又能通过间接接触传染（例如分泌物、排泄物、畜产品、污染的空气、饲料等）传给易感动物。

口蹄疫的主要传播途径是消化道和呼吸道、损伤的皮肤、黏膜以及完整皮肤（如乳房皮肤）、黏膜（眼结膜）。另外还可通过空气，也可以通过尿、奶、精液和唾液等途径传播。

我国对口蹄疫的防治，预防主要通过疫苗注射接种，发生口蹄疫的则捕杀。

早在17－19世纪，德国、法国、瑞士、意大利、奥地利已有口蹄疫的流行记载。历史上，1951-1952年在英法爆发的口蹄疫，造成的损失竟高达1.43亿英镑；1967年英国口蹄疫大爆发导致40万头牛被屠宰，损失1.5亿英镑。英、法国等国家爆发口蹄疫后，严重影响到了猪肉的售价。而大量宰杀牲畜后，需要饲养的牲畜已所剩无几，市场对动物饲料的需求大减，造成玉蜀黍和大豆等动物饲料的价格下跌。

国际上英美等发达国家都已全面消灭了口蹄疫，在发展中国家中，中国也走在牲畜防疫的前列。复旦大学生命科学院、上海农科院畜牧所、浙江农科院病毒所和中国农科院兰州兽医所，经过18年潜心攻关，已成功研制出抗口蹄疫基因工程疫苗---“抗猪O型口蹄疫基因工程疫苗”。中国科学院上海植物生理生态研究所科技人员，利用烟草病毒制成一种高安全性新型医用疫苗，这种疫苗对口蹄疫病毒有特效。

FMDV是偶蹄类动物高度传染性疾病-－口蹄疫的病原，由一条单链正链RNA和包裹于周围的蛋白质组成，蛋白质决定了病毒的抗原性、免疫性和血清学反应能力；

病毒外壳为对称的20面体。

FMDV在病畜的水泡皮内和淋巴液中含毒量最高。在发热期间血液内含毒量最多，奶、尿、口涎、泪和粪便中都含有FMDV。不过，FMDV也有较大的弱点：耐热性差，所以夏季很少爆发，而病兽的肉只要加热超过 100℃也可将病毒全部杀死

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患口蹄疫的动物会出现发热、跛行和在皮肤与皮肤黏膜上出现泡状斑疹等症状。恶性口蹄疫还会导致病畜心脏麻痹并迅速死亡。

排病毒量：在病畜的内唇、舌面水疱或糜烂处，在蹄趾间、蹄上皮部水疱或烂斑处以及乳房处水疱最多；其次流涎、乳汁、粪、尿及呼出的气体中也会有病毒排出。

人一旦受到口蹄疫病毒传染，经过2－18天的潜伏期后突然发病，表现为发烧，口腔干热，唇、齿龈、舌边、颊部、咽部潮红，出现水疱（手指尖、手掌、脚趾），但可把病毒传染给牲畜动物，再度引起畜间口蹄疫流行。

口蹄疫传染途径多、速度快。发病或处于潜伏期的动物是主要的传染源。病毒可通过空气、灰尘、病畜的水疱、唾液、乳汁、粪便、尿液、精液等分泌物和排泄物，以及被污染的饲料、褥草以及接触过病畜的人员的衣物传播。口蹄疫通过空气传播时，病毒能随风散播到50－100公里以外的地方。牛、羊、猪等高易感动物，感染发病率几乎为100%。一般来说，成年动物患口蹄疫的死亡率在5%－20%之间，幼畜的死亡率50%－80%。口蹄疫病毒血清类型多，易变异。已发现的口蹄疫病毒有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3和ASIA1等7个血清型。各型的抗原不同，不能相互免疫。

疫苗接种是特异性预防FMD的可靠和有效手段，安全有效的疫苗是成功地预防、控制乃至最终消灭FMD的先决条件。FMD弱毒疫苗和灭活疫苗等常规疫苗都具有良好的免疫原性，在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用，但由于病毒毒力返强、病毒灭活不彻底、活病毒逃逸加工厂等不安全因素，世界上一些地区FMD的暴发似乎与灭活疫苗中残存的活病毒有关，促使人们寻求一种更加安全有效的FMD疫苗。随着分子生物学技术的飞速发展，FMDV基因工程疫苗如亚单位疫苗、可饲疫苗、合成肽疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗等不断涌现。

亚单位疫苗

基因工程亚单位疫苗是指采用基因工程手段制备病原体亚单位成分，由于亚单位疫苗只含有病原体的一部分，不会引起病原体所导致的动物发病，在安全性方面大大提高。

FMDV基因工程亚单位疫苗主要是利用各种表达系统表达VP1蛋白，制成疫苗。Kupper等（1981）克隆了FMDVVP1基因，将其插入到原核表达载体PL启动子的下游，实现VP1基因的原核表达，并通过间接ELISA和放射免疫试验证实了其表达产物具有抗原性，从而为FMDV基因工程亚单位疫苗的研制提供了理论依据。同年Kield用大肠杆菌表达的A型FMDVVP1蛋白免疫猪和牛，都可诱导中和抗体的产生，用高浓的VP1蛋白或重复接种牛，可使牛抵抗FMDV强毒的攻击。Morgan证实：用A12-32二聚体多次接种猪，猪也可产生高水平的中和抗体，可以保护猪免受强毒的攻击，但是该技术不适合O型FMDV。已经发现FMDV结构基因和非结构基因2A、3C串联起来表达，可以产生76S的类病毒粒子，提纯该病毒粒子，用来免疫动物，其免疫效果类似于全病毒，可产生高水平的中和抗体，能抵抗强毒的攻击，并彻底解决了FMDV常规疫苗散毒的危险，显示其良好的年个月度年个前景。除此以外，酵母和杆状病毒系统也用来表达VP1蛋白，解决VP1蛋白在原核表达系统中不被修饰加工等问题，以期提高其免疫原性。

可饲疫苗

可饲（食）疫苗即利用脓杆菌或基因枪等技术，将免疫原性基因导入植株中，获得表达免疫原性蛋白的植株。

FMD转基因植物可饲疫苗是研究较早，并且效果较好的例子之一。早在1998年，Carrillo等用FMDV的主要保护性抗原基因VP1获得了转基因拟南芥，用叶浸提物免疫小鼠，可诱导产生特异性抗体，所有免疫的小鼠都能抵抗FMDV强毒半数致死量的攻击，这是有关转基因植物表达的病毒抗原使免疫动物全部获得保护的首篇报道，而且一个免疫剂量仅为25-50mg叶片。1999年Wigdorovitta等又利用苜蓿作为受体材料，成功获得了转基因苜蓿，以15-20mg剂量免疫小鼠，免疫鼠能100%抵抗致死量强毒的攻击。Carrillo等又以马铃薯作为受体材料，成功获得了表达VP1的转基因马铃薯，动物实验证实免疫鼠也能抵抗强毒的。FMDV转基因植物可饲疫苗的研究成功，将为牛、羊等草食动物FMD的防治带来光明的前景。

合成肽苗

合成肽苗即用根据免疫抗原表位的氨基酸序列合成的抗原决定基小肽制作的疫苗。一般是从蛋白质的一级结构并结合单克隆抗体的分析，推导出蛋白质免疫主要抗原表位的氨基酸顺序，然后合成或基因工程表达这一段肽作为抗原。

Dimarch用合成O1K病毒VP1141-158和200-213片段氨基酸组成的40个氨基酸肽（半胱氨酸-半胱氨酸-200-213-脯氨酸-脯氨酸-丝氨酸-141-158-脯氨酸-半胱氨酸-苷氨酸），在其中间加上两个脯氨酸和一个丝氨酸，使多肽折成立体构型，达到提高了单段肽（141-158-脯氨酸-半胱氨酸-苷氨酸）在豚鼠中的应答水平，并提出了N-末端氨基酸（半胱氨酸-半胱氨酸）在提高保护应答的重要性。Brown等用化学法合成了FMDVVP1基因编码的140-160及200-213位肽段基因片段，并在大肠杆菌体内得到了表达，用其免疫牛、猪等都获得了较好的免疫力。Doel分别用A、O、C血清型FMDVVP1序列的141-158和200-213肽段组成的40个aa合成肽，用牛和豚鼠进行了试验，结果每个肽都产生了特异性高水平抗病毒中和抗体，在豚鼠中O、A型肽可抗各自病毒的攻击并获得完全保护，C型较差。

蛋白质载体疫苗

FMDV是细胞内增殖，其免疫应答依赖于T细胞，因而细胞因子免疫性在抗病毒防御方面起着特别重要的作用。鉴于此，人们FMDVB细胞或T细胞抗原表位与发的蛋白质分子基因或与形成类病毒粒子（Viruslikeparticle）的结构基因融合，利用载体基因蛋白或类病毒粒子的抗原提呈作用，刺激T细胞，增殖机体细胞免疫反应。Bittle根据FMDVO1型VP1氨基酸序列，化合合成140-160段氨基酸肽与载体蛋白偶联，能诱导保护豚鼠的中和抗体。Broekhuijsen在β半乳糖苷酶N-末端连接VP1基因的B细胞和T细胞抗原表位单拷贝或多拷贝分子，用表达的融合蛋白接种豚鼠，能诱导高水平的中和抗体，刺激T细胞，产生细胞免疫应答，抵抗强毒的攻击。同年Clarke利用乙型肝炎病毒核心蛋白能自我包装成类病毒粒子，将FMDV的B细胞和T细胞抗原表位连接到其蛋白的N-末端，并在痘病毒中表达，其表达的融合N蛋白在豚鼠和猪中都可诱导高水平的中和抗体。Chan将FMDVVP1的141-160aa和200-213aa串联起来与猪IG的重链基因的末端融合，用其表达产物免疫的猪，可以抵抗50LD50的FMD的攻击。由于蛋白质载体疫苗安全性高，免疫原性好，故具有诱人的应用潜力。

基因缺失疫苗

运用基因工程手段克隆FMDV全长cDNA，构建感染性克隆，在DNA水平上来RNA，通过缺失与病毒力相关的基因，减弱其毒力但不丧失其免疫原性。

FMDV与Mengo病毒同属小RNA病毒，人们已通过DNA重组技术，将Mengo病毒polly（C）片段缩短，构成突变体，这种突变体对小鼠无害，而且在小鼠体内能产生高水平的抗体，保护小鼠免受强毒的攻击，因而研究人员试图借鉴Mengo病毒的经验，FMDVpoly（C）片段缩短，虽然缩短了poly（C）片段的FMDV突变体的毒力没有减弱，但这给人们某种启发，对FMDV基因组特定位点的缺失，极有可能构建FMDV弱毒株。

X射线晶体分析发现，FMDV具有一定立体构象，其表面由VP1-VP3组成，在VP1的一个高度可变区域内，有一高度保守的β环状（G-H环）氨基酸序列暴露于病毒粒子的表面，其中包含精氨酸-苷氨酸-天门冬氨酸（RGD）序列，构成病毒的细胞吸附位点。Ochoa等人研究FMDVVP1基因片段的主要抗原位点G-H环合成肽晶体结构时发现，针对VP1单抗可以产生一定程序的病毒凝集和很强的抑制病毒与细胞吸附作用。Acharya等也发现含有RGD序列的感染性的cDNA克隆，制备RGD缺失或突变的病毒粒子就成为可能。Mason通过取代病毒RGD序列内的氨基酸构建FMDV突变株，使病毒不能吸附和感染细胞。以上的研究均证实RGD序列是病毒吸附宿主细胞所必需的。Mckenna等用SGSNPGSL序列取代野生型SGSGVRGDFGSL的RGD编码序列，构建了RGD缺失病毒。这种缺失RGD序列的病毒粒子不吸附和感染细胞。利用该缺失病毒进行小鼠和猪的动物试验发现，野生型病毒对照组出现典型的FMD症状，试验组无任何症状。通过免疫沉淀监测了这些动物在接种28d后的血样，其中对照组显示很强的结构蛋白活性，没有测到非结构蛋白活性，证明了野生病毒在动物中能复制，而所构建的病毒不能复制。用海福特牛对这种病毒所做的油作比较，证明在产生血清中和抗体、刺激机体产生免疫应答、动物保护等方面与灭活疫苗一致，有些优于灭活疫苗。

活载体疫苗

利用基因操作技术将FMDV的保护性基因（VP1或P1）插入到另一种病毒基因组中的某些部位，使之高效表达重组蛋白。由于外源性木的基因VP1或P1已成为载体的一部分，并随着载体病毒增殖而不停地表达，因而这种活载体疫苗在机体不但不能产生针对载体的抗体，而且可以产生针对FMDV的抗体，从而达到“一针防两病”的目的。另外，针对FMDV多血清型，而且型间无交叉保护作用，因而可将不同型FMDVVP1或P1基因插入到同一病毒活载体中，从而组成多价基因工程疫苗来预防、控制FMD及其他相关疾病。常用的病毒载体主要有痘病毒，腺病毒、疱疹病毒等。Sanz-Parra等构建表达FMDVVP1和VP1基因的重组痘病毒，用该重组病毒接种豚鼠，产生针对FMDV的B细胞和T细胞的免疫反应，2000年，BerinsteinA等构建了表达FMDVC3Arg85毒株的P1基因重组痘病毒，用该重组痘病毒接种Balb/c小鼠，用ELISA检测出高效价的抗FMDV抗体，同时能保护同源病毒强毒的攻击；GregoryA等，用表达FMDV结构蛋白腺病毒型免疫猪，4周后用相同剂量加强免疫一次，产生高水平的FMDV中和抗体，5/6免疫猪得到了FMDV结构蛋白的VP1多肽，用该重组病毒接种牛诱导高水平的抗FMDV抗体。伪狂犬病病毒与牛传染性鼻气管炎病毒属于疱疹病毒，基因组约150kb，含有许多病毒增殖和复制所非必需的基因，能容纳的外源基因多，是一种很好的病毒载体。Ziji等成功地将猪瘟病毒膜蛋白E1基因插入PRV738株gC基因中得到表达，制成的疫苗使免疫猪获得了较好的免疫力，并可抵抗PRV强毒和猪瘟ngdu的攻击。除病毒活载体疫苗外，菌体也用来作为载体，已有人将FMDVVP1的部分抗原肽在菌体系统中嵌合表达。

核酸疫苗

核酸疫苗又称基因疫苗，是将编码病原体免疫保护性抗原蛋白基因置于真表达元件的控制下，并将其导入动物机体内，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，从而诱导宿主产生对抗原蛋白的免疫应答。由于FMDV血清型多，各型间无交叉保护性，这给FMD的仿制带来巨大的困难。90年代，随着基因免疫概念的问世及完善，为FMDV免疫带来契机。Benvenisti将FMDV完整的结构基因P1和非结构基因2A、3CD串联起来，同时加入脑心肌炎病毒（EMCV）内部核糖体进入(IRES)，并通过免疫荧光和免疫斑点技术检测到猪皮肤中，部分猪获得抵抗FMDV强毒的攻击。Shieh未了克服亚单位疫苗不能产生持久的免疫保护，通过基因免疫和亚单位疫苗联合免疫来增强其免疫效果，首先用含有FMDV主要免疫原性VP1的质粒免疫鼠，接下来VP1多肽偶合物（P29-KLH）刺激，免疫的鼠产生高效价的抗体，并具有中和FMDV活性。

总之，理想的疫苗必须安全、有效、同时还应具备价廉、易于推广等优点。虽然FMDV灭活疫苗具有良好的免疫原性，但潜在的不安全性影响其使用；另外，由于灭活疫苗制备成本高，价格昂贵，限制了该疫苗的推广。基因疫苗经验有安全性高，同时可以根据需要制备同一病毒多哥成分或多价病毒疫苗，大幅度节约生产成本等优点，因此，FMDV记忆内工程疫苗是未来的发展方向。

动物患口蹄疫会影响使役，减少产奶量，一般采用宰杀并销毁尸体进行处理，给畜牧业造成严重损失。国际兽疫局将口蹄疫列为“A类动物传染病名单”中的首位。世界上许多国家把口蹄疫列为最重要的动物检疫对象，中国把它列为“进境动物检疫一类传染病”。口蹄疫很少感染人类，但人类接触或摄入污染的畜产品后，口蹄疫病毒会通过受伤的皮肤和口腔黏膜侵入人体。人口蹄疫的特征是突然发热，口、咽、掌等部位出现大而清亮的水疱，没有有效的治疗办法，这些症状经2－3周后可自然恢复，不留疤痕。因此，对人体健康的危害不大。

有效防治猪口蹄疫的有效措施

做好日常预防工作

减少猪口蹄疫发生的关键在于预防，主要应采取以下措施：

1. 消毒。消毒是日常预防工作的重点，选择口蹄疫敏感消毒剂，在多发季节要每天利用消毒剂进行1 次消毒，其他时间段一个星期消毒1-2 次。消毒范围包括猪场大门、猪圈门口、猪蹄等，最好在猪圈门口设置消毒池，便于消毒。

2. 口蹄疫接种。相关部门要加强猪口蹄疫疫苗接种宣传，并指导养殖户选择正确的接种疫苗。具体来说要做好以下三点：第一，对于疫区来说，可采取自制的康复血清对小猪接种，预防小猪因突发急性心肌炎死亡。第二，对于规模化养殖厂来说，要采取疫苗注射、消毒、病猪及时隔离等措施，特别是在高发季节。一旦发生口蹄疫，则要立即隔离病猪，并扑杀病情严重、传染性强的猪，并注射康复血清。第三，严格按照免疫程序执行。根据猪口蹄疫发病特点、病理、症状等制定合理的免疫程序并严格执行。一般来说种母猪1 年要免疫2～3 次，且配种前必须免疫1 次；对于初产母猪来说，配种期间要免疫2 次，且2 次免疫间相隔1 个月左右。对于小猪来说，在其出生55～65d 之间，要进行第1 次免疫，随后25～30d 内进行第二次免疫。第四，选择高效、正确的疫苗。可采取合成肽疫苗，且接种疫苗时要辅以黄芪多糖，既可以保护猪，减少不良反应，而且可以提高免疫效果

治疗对策

对症治疗，促进创口愈合。根据病猪不同临床表现采取针对性的治疗方法。对于临床症状无特异性、纳差的病猪来说，采取天行健的口蹄一针灵、黄芪多糖等治疗，治疗1天。且在饲料或水中适当添加维生素C，补充营养。对于乳房、猪蹄水疱明显的病猪来说，采取黄芪多糖、阿莫西林及恩诺沙星联合治疗，1 次/d，治疗3d。同时用碘甘油涂抹创口，高锰酸钾治疗口腔内溃疡等。对于康复期的病猪来说，要连续给予阿莫西林治疗7～10d。此外，口蹄疫发病期间，要用碘制剂、过氧乙酸等合理消毒，1 次/d[4]。同时火碱冲洗空猪圈及病死猪圈，其他地方撒生石灰。年龄、体重不同，治疗方案不同。超过25kg的猪只需消炎排毒，如阿莫西林。若疼痛难忍，则给予破痛宁治疗，缓解猪疼痛，能站立进食。若病猪出现口腔内溃疡症状，则要行高锰酸钾冲洗口腔。乳房等部位可涂抹青霉素软膏。不足1kg的猪可能存在急性心肌炎潜在威胁，为此要行康复血清紧急接种，降低死亡率。

若刚起水泡，水泡没有破裂，只需用口蹄一针灵注射一次，水泡即可干瘪消失。若口鼻、蹄子周围的水泡已破溃，流血，甚至蹄壳已脱落，需用口蹄一针灵注射两次，水泡破溃处可结痂。每瓶100kg体重配合核酸肽连续注射2天。

发生口蹄疫的重疫区

1.尽早注射，越早越好，病毒控制在潜发期，提高猪群免疫力。

2. 已感染猪群注射两天，4-5天结痂脱落后完全恢复正常，可解除隔离。

3. 对感染后恢复的弱仔群体，每天加强消毒，五天后注射再加强一针，防止再次感。

疫区净化

若发生口蹄疫，则要全面、及时的对整个疫区进行消毒、封锁、上报等工作，争取把疫情失降到最低。

结论

口蹄疫防治工作不单是猪养殖厂的责任，而是全社会共同参与的项目。要进一步研究接种疫苗，做好猪饲料、种猪管理工作，定期消毒养猪场，有效预防口蹄疫。一旦发生口蹄疫，要快速反应，及时划定疫区，严格封锁，采取有效措施控制疫情。

FMDV能在多种动物细胞内增殖, 包括原代细胞, 如牛舌上皮细胞、牛甲状腺细胞、牛胎皮肤-肌肉细胞、仔猪心肌细胞、猪肾细胞、仓鼠肾细胞、牛肾细胞和豚鼠肾细胞等, 还有传代细胞系, 如犊牛甲状腺细胞系、猪肾上皮细胞 (PK-15) 、仔猪肾上皮细胞 (IBRS-2) 和仓鼠肾细胞 (BHK-21) 等, FMDV对原代细胞的敏感性虽然较传代细胞好, 但是其在原代细胞上达到的病毒含量低于传代细胞系 (原代细胞每0.1g组织含1TCID50~5TCID50, 传代细胞中可达106TCID50~107.5TCID50) 。此外, 不同型毒株在同一细胞及同一毒株在不同细胞上的生长状态有一定的差异。犊牛甲状腺细胞对FMDV最敏感, 适于感染组织分离增殖病毒。FMDV在牛舌上皮细胞内易于生长, 24 h收获病毒时, 毒价可达106TCID50/mL~108TCID50/mL。IBRS-2细胞系和BHK-21细胞系常用于进行口蹄疫病毒的分离培养。口蹄疫病毒的培养技术主要为贴壁培养技术和悬浮培养技术, 后者是FMDV大规模培养的主流模式