1924年1月被选为国民党候补中央委员。

1925年1月在上海出席中国共产党第四次全国代表大会。5月因参加破坏国共合作，反对无产阶级革命，被中共中央开除党籍。同年11月出席国民党右派非法召开的西山会议，堕落为国民党右派“ 西山会议派” 分子。

1926年出席西山会议派在上海召开的国民党二大，被选为中央执行委员。1927年四一二反革命政变后，任国民党浙江省党部改组委员会委员、清党委员会常务委员、省党部秘书长、省反省院院长等职。参与逮捕、杀害共产党人和国民党左派人士的“清党” 活动。同年底辞职回乡试办农村地方自治。

1928年8月28日在衙前被刺身亡。著有《玄庐文存》。

沈定一于日本留学期间，在东京加入同盟会。辛亥革命爆发，参加光复上海的武装起义，同时又招收革命青年1300余人，在沪创立“中华民国学生团”，自任团长，受到孙中山的嘉奖。

1912年1月，被选为浙江省议会议员。袁世凯篡权，沈定一在上海组织“公民急进党”倒袁，并在长江中下游各大城市发展组织。1913年，孙中山发动“二次革命”，沈奋起响应，10月倒袁失败后遭通缉，于次年避居日本。在日本参加留日学生总会，任总干事。后与刘大白等人往南洋新加坡、苏门答腊等地。1916年6月回国，9月当选为第二届浙江省议会议长。其间，议决兴办省立第二、第三、第六、第八、第九师范学校，培养师资，普及教育。为阻止北洋军阀对浙江的控制，再遭通缉，旋去上海。1920年沈定一与陈独秀、李达在沪组建上海共产主义小组。1922年，沈定一仍居乡间，致力发展乡村教育，曾任萧山东乡教育会会长。1924年沈定一与陈望斗、林风眠、潘天寿等先生一起创办了“浙江艺专”（现“中国美院”），该校1927年被军阀孙传芳部队毁掉，为中国培养了不少，书画人材，为繁荣中华书画艺术作出巨大的贡献。

五四运动前后，沈定一立足上海，提倡白话文和文学革命。1919年6月，与李汉俊、戴季陶等共同在上海创办《星期评论》周刊，宣传新思想，研究和介绍社会主义和世界劳工运动，为世人瞩目。该刊共出53期，沈撰写诗文124篇。1920年，沈和陈独秀、李汉俊等早期革命者交往甚密。1920年5月，与陈独秀等在上海发起组织“马克思主义研究会”，相继在《劳动界》《劳动与妇女》杂志上撰写文章，宣传革命思想。沈定一是中国共产党的最早党员之一。1920年8月，陈独秀、李达在沪组建上海共产主义小组。1921年初，陈独秀去广州，创办《劳动与妇女》杂志，沈任主编。

沈定一是衙前农民运动的发起者、组织者和领导人。他把党的农民革命思想灌输到农民中，并培养出“农民斗士”李成虎等一批农民先进分子，使得衙前农民革命运动迅速开展起来。

1921年4月，沈定一回到家乡萧山衙前，开展教育农民、组织农民的农村革命斗争。他身穿普通农民衣服，操着家乡方言，用农民常见的事例作比喻，不仅使农民听得懂，也说到了农民的心坎上。8月19日，沈定一在龛山作了题为《谁是你们的朋友》的演讲，从“金钱的发生”揭露剥削的秘密，提出“世界上一切东西，都应该归劳动者所有。”9月23日，在船坞山北作了《农民自决》的演讲，进一步揭露了地主剥削的残酷，亮出了“废止私有财产”、实现“土地公有”的政治主张，使农民听了“如见天日”。他为了迅速建立农民组织，独资创办衙前农村小学，作为开展农民运动的基地，邀请浙江第一师范学校和浙江女子师范学校进步师生刘大白、宣中华、徐白民、唐公宪、杨之华等来校任教。以学校为阵地帮助农民学文化，宣传革命道理，引导青年学生走工、农相结合的道路，发动农民，筹建农民协会，主张“农民自决”。

在沈定一等人的共同努力下，培养和团结了一批农民积极分子，如萧山的李成虎、绍兴的单夏兰等。沈定一支持李成虎等贫苦农民保卫自身利益的斗争。一次是打米店。这年5月，正值青黄不接之时，粮商乘机提高米价，引起农民的气愤。在沈定一等的支持下，李成虎把围身布绑在竹竿上当大旗，带领农民捣毁龛山“周和记米店”及附近哄抬物价的米店，迫使粮商恢复原价。一次是争得了被绍兴县官绅把持的西小江的养鱼权和捕鱼权。这让农民看到了自身团结的力量，提高了斗争的信心和勇气。1921年9月，发动了以萧山衙前为中心的萧绍农民运动，成立了全国第一个有纲领、有章程的农运组织—衙前农民协会，开展抗租减租斗争。期间，多次到绍兴县进行宣传和组织活动，是最早在绍兴进行革命活动的中共党员。在他和徐梅坤等指导下，绍兴农民骨干先后在前梅、钱清等地组织50个乡村农民协会。沈定一首先自减田租并拿出钱财分与贫苦农民。9月27日在衙前东岳庙召开农民大会，成立衙前农民协会，并通过由他起草的《衙前农民协会宣言》和《衙前农民会章程》，明确宣布“本会与田主、地主立于对抗地位”，并实行三折还租。同年，该《章程》与《宣言》刊登在党的机关刊物《新青年》上，引起社会关注。衙前农民协会的创立，其影响波及萧绍平原，时有80多个村相继仿行。12月，在绍兴《越铎日报》上发表《农民自决》一文，鼓励农民起来抗租。年底，农民协会遭军阀政府镇压而强迫解散。衙前农民运动，虽然时间不长，但影响很大，它揭开了中国现代农民革命斗争的序幕，显示了农民群众中蕴藏的巨大革命力量。

1923年8月，沈定一参加“孙逸仙博士代表团”，同蒋介石等4人赴苏联考察，年底回国，加入国民党。1924年1月，沈定一参加国民党第一次全国代表大会，当选为中央候补执委。3月回浙江组建中国国民党浙江省临时党部，为执行委员。1925年1月，沈参加在上海召开的中国共产党第四次全国代表大会，与会期间，他指责党的路线，反对国共合作，公然违反党的纪律，遭到代表们的严肃批评。5月，沈赴广州出席国民党一届三中全会，又与戴季陶一起反对国共合作，主张反共，附和戴季陶提出的所谓纯粹的三民主义，公开背叛中国共产党的宗旨，被中共中央开除党籍，但亦有一种说法是，他本人因反对陈独秀的家长作风而退党。7月5日，沈定一回衙前主持召开国民党浙江临时省党部执委会全会，会上沈和戴季陶一起主张“分共”，遭到宣中华（共产党员、国民党临时省党部执委）等的坚决反对。11月，沈到北京参加国民党右派非法召开的“西山会议”（一届四中全会）；1926年1月，在国民党第二次全国代表大会上，沈定一受到书面警告的处分。1926年3月，沈仍参加谢持、邹鲁等“西山会议派”在上海非法召集的国民党伪“二大”，被选为中央常务委员。四一二反革命政变后，沈历任国民党中央农民运动委员会委员、国民党浙江省党部改组委员兼秘书长、省党部特派员、省清党委员会常务委员、省反省院院长等职。

1927年4月12日，蒋介石发动反革命政变，沈定一在浙江拉拢各方势力，为蒋介石摇旗呐喊。蒋汪“合流”后，国民党内部争权夺利的斗争激烈，蒋介石以退为进，于1927年8月下野，“西山会议派”掌握了国民党中央大权。反共急先锋沈定一再受重用，获得了国民党中央农民运动委员会委员长的顶戴，并以国民党中央党部浙江特派员的身份回到浙江，担任浙江省清党委员会主任委员。

在反革命的“清党”活动中，亲自带领国民党特务到各地收缴枪支，查封革命团体，大肆搜捕共产党员和革命群众，使浙江笼罩在一片白色恐怖之中。为了“感化”共产党人，他拨出款项，网罗反共人士，建立起专门关押共产党人和革命志士的浙江反省院，并亲任院长。这时，沈定一已经从一个对中共建党有贡献的人，蜕变成彻头彻尾的反共急先锋。

在严峻的革命形势下，党的组织秘密转入地下。但是，由于沈定一曾在中共党内担任职务，对中共浙江党内的情况和中共党员的分布情况比较了解，因此在国民党特务的大肆搜捕中，中共浙江党组织的秘密机关遭到严重破坏，许多共产党人和革命志士遭到捕杀。据有关资料，沈定一担任国民党“清党”委员会主任委员期间，浙江省1800多位革命者被捕，932位中共党员被杀害，原来生气勃勃的江南大地陷入了一片腥风血雨之中。

1928年春蒋介石东山再起，重掌国民党大权。沈定一见势不妙，无奈中回到浙江萧山衙前，在戴季陶、张静江等人的支持下，一面撰写《防共方案》，陈述自己反共反革命立场，一面在衙前成立自治筹委会，建立东乡自治会，集结旧友亲信，分任要职，以图推翻蒋介石统治。沈定一的举动，引起了蒋介石的警觉和不安。

1928年8月，沈定一在赴莫干山会晤戴季陶的返途中突遭枪杀。据徐梅坤《九旬忆旧》记载：“蒋介石通过何应钦派刺客在衙前刺杀了沈定一。

沈定一出身于官僚地主家庭，兄弟三人，排行居三，人称“三先生”。