玛丽·德·美第奇于意大利佛罗伦萨的皮蒂宫出生，是托斯卡纳大公弗朗切斯科一世·德·美第奇和奥地利的约翰娜女大公的第六个女儿。玛丽不是洛伦佐·德·美第奇的男性后裔，而是来自美第奇家族的另一个分支——老洛伦佐的后裔。然而玛丽的确是洛伦佐·德·美第奇的女性后裔，她的祖父科西莫一世·德·美第奇是洛伦佐·德·美第奇的女儿卢克雷齐娅·德·美第奇的外孙。她的母亲约翰娜还是卡斯蒂利亚国王腓力一世和卡斯蒂利亚女王胡安娜的直系后裔。玛丽有6个兄弟姐妹，但只有她和姐姐埃莱奥诺拉·德·美第奇活至成年。从玛丽年轻时的画像可以看出，她五官端正，前额宽大，有着一头浅棕色的卷发，一双蜜棕色的眼睛和白皙的皮肤。

虽然玛丽为亨利生下了多名子女，但他们的婚姻并不幸福。玛丽与亨利的情妇长期不和。她经常与亨利的首席王室情妇卡特琳·亨利埃特·德·巴尔扎克·德特赖格争吵，亨利曾答应卡特琳在他的前任官方情妇加布丽埃勒·德斯特雷去世后就与她结婚。当亨利失信娶了玛丽后，就导致了持续不断的争吵和幕后的政治阴谋。卡特琳将玛丽称为“胖银行家的女儿”，亨利将玛丽当作生育机器，就像亨利二世对待凯瑟琳·德·美第奇一样。虽然国王本可以轻易地驱逐他的情妇，支持他的王后，但他从来没有这样做过。相反，玛丽对被亨利流放的前妻玛格丽特表示极大的同情和支持，她还鼓动亨利允许她返回法国。1610年5月13日，也就是她丈夫去世前一天，玛丽被加冕为法国王后。亨利遇刺数小时后，巴黎议会批准她为摄政王。随后，她立刻把亨利的情妇卡特琳逐出宫廷。