正常条件下，小麦和玉米受OTA污染的机率较小，约1%～5%，其含量为0.01～5mg/kg；大麦和燕麦被污染的机率较高，约为10%，其含量一般在0.1mg/kg以下，个别样品高达27mg/kg；据Zust等（1989）和Egmond（1994）报道，配合饲料约有5%～10%被污染，OTA含量0.05～0.4mg/kg。魏润蕴等（1981）和牛钟相等（1989）在粮食和饲料中也检测出了OTA。另外，从王海彬等（1996）和王景琳等（1994）的调查结果，中国饲料曲霉菌和青霉菌的检出率也很高。

现已发现有7种曲霉和6种青霉菌能产生赭曲霉毒素A，但主要由纯绿青霉、赭曲霉和碳黑曲霉产生。该毒素主要污染粮谷类农产品如燕麦、大麦、小麦、玉米、动物饲料和动物性食品(如猪肾脏、肝脏)等。赭曲霉毒素A是苯丙氨酸与异香豆素结合的衍生物。

OTA最早是由VanderMerwe等（1965）从赭曲霉菌（Aspergillusochraccus）（据Marquardt和Frohlich，1992，报道该菌现在称为A．alutaceus）培养物中提纯得到的。魏润蕴等（1981）和孙惠兰等（1989）也分别从粮食和配合饲料中提出OTA纯品。分析表明OTA由7-羧-5-氯-8-羟-3，4-二氢-R-甲基异香豆素（简称Oa下同）和L-β-苯丙氨酸通过肽键连接而成（见图赭曲霉毒素A的化学结构），分子式：C20H18CINO6，分子量403。

OTB是OTA的脱氯衍生物，OTC是OTA的乙基酯。OTA为无色晶体，溶于有机溶剂（氯仿和甲醇）和稀碳酸氢钠溶液，微溶于水。在紫外线照射下OTA和OTB分别呈绿色和蓝色荧光，最大吸收峰分别为333nm和318nm。

赭曲霉毒素A对动物和人类的毒性主要有肾脏毒、肝毒、致畸、致癌、致突变和免疫抑制作用。赭曲霉毒素A进入体内后在肝微粒体混合功能氧化酶的作用下，转化为4一羟基赭曲霉毒素A和8一羟甚赭曲霍毒素A，其中以4一羟基赭曲霉毒素A为主。

赭曲霉毒素的毒性强弱顺序是：OTA>OTC>OTB。这在很大程度上取决于分子中第八位羟基的电离常数大小。OTB和OTC在被污染饲料中的含量一般较低，对大多数动物的毒性较OTA小。因此，饲料检测时可以不考虑，主要分析OTA含量。近来Creppy等（1983）和Hadidane等（1992）用色氨酸、缬氨酸、赖氨酸等氨基酸取代OTA分子中的苯丙氨酸，获得了一系列OTA类似物，其中酪氨酸、缬氨酸、苏氨酸和丙氨酸取代类似物的毒性最强，蛋氨酸、色氨酸和谷氨酸取代类似物次之，谷酰胺和脯氨酸取代类似物的毒性最低。Hadidane等（1991）报道，自然界也存在OTA的苏氨酸、羟脯氨酸和赖氨酸取代类似物。

Marquardt等（1992）调查表明，饲料中OTA含量在0.3～16mg/kg时可引起畜禽中毒，使死亡率上升2%～58%。Madsen等（1982）报道，连续饲喂含OTA200μg/kg的饲料4个月，对猪的影响不大，而当OTA含量大于1400μg/kg时，显著降低猪的采食量和生长速度，饮水量增加。Huff等（1974）报道，连续饲喂含0.5～1.0mg/kgOTA的饲料3周，对肉仔鸡的增重无影响，而含0.5mg/kgOTA的饲料连续饲喂6周，可降低蛋鸡的产蛋性能和饲料转化率。

Dwivedi和Burns（1985）报道，OTA可引起畜禽免疫器官变化，使多种动物胸腺、法氏囊、脾脏和淋巴结中的白细胞数量降低，巨噬细胞和单核细胞的迁移能力下降。从Lee等（1989）的资料看，似乎还可以抑制细胞免疫（T细胞和B细胞）的活性。

Appelgren和Arora（1983），Kovasf和Vanyl（1994）报道，OTA可以透过胎盘对胎儿具有致畸作用，但猪对其不太敏感。对OTA致癌作用的研究目前尚停留在试验动物阶段，未见有关畜禽方面的报道。Krogh（1991）报道，血液总蛋白、白蛋白和球蛋白含量，以及肾脏磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）活性都可作为OTA中毒的敏感指标。

对OTA的中毒机理研究得较多，Endou等（1984）报道，OTA可抑制肾脏近曲小管上皮细胞的阴离子运输系统，使尿中丙氨酸氨基肽酶（alanineaminopeptidase）和亮氨酸氨基肽酶（1euineaminopeptidase）浓度升高。Meisner等（1983，1986）先后证明，OTA可抑制肾脏PEPCK的活性，进而抑制肾脏葡萄糖生成，然而对OTA的抑制方式尚无定论。Creppy等（1983）报道，OTA还是苯丙氨酸-tRNA合成酶的竞争性抑制剂，该酶对OTA的亲和力大于苯丙氨酸，因而可抑制细胞内蛋白质的合成。

赭曲霉毒素是由赭曲霉（Aspergillusochraceus）和纯绿青霉（Penicilliumviridicatum）产生的一种霉菌肾毒素，可分为A和B两种类型，A的毒性较大。赭曲霉毒素在4℃的低温下赭曲霉即可产生具有毒害作用浓度的赭曲霉毒素。动物摄入1ppm体重剂量的赭曲霉毒素A可在5~6天致死。常见的病变是肾小管上皮损伤和肠道淋巴腺体坏死。饲喂含1ppm浓度赭曲霉毒素的日粮3个月可引起动物烦渴、尿频、生长迟缓和饲料利用率降低；饲喂含量低至200ppb的日粮数周可检测到肾损伤。其他的临床症状还有腹泻、厌食和脱水。有时临床症状不明显，而在赭曲霉毒素中毒呈地方流行病的地区，动物在屠宰时惟一可观察到的病变是肾苍白、坚硬。

①、赭曲霉毒素A阻断氨基酸tRNA合成酶的作用而影响蛋白质合成，使得IgA、IgG和IgM减少，抗体效价降低。

②、损伤禽类法氏囊和畜禽肠道淋巴组织，降低抗体的产量，影响体液免疫，这和赭曲霉毒素的致癌作用有关。

③、引起粒细胞吞噬能力降低，从而影响吞噬作用和细胞免疫。

④、赭曲霉毒素A能通过胎盘影响胎儿组织器官的发育和成熟。

OTA主要毒害动物的肾脏和肝脏，肾脏是第一靶器官，只有剂量很大时才出现肝脏病变。其中猪和禽类的敏感性最强。OTA的急性中毒反应为精神沉郁，食欲减退，体重下降，肛温升高。消化功能紊乱，肠炎可视黏膜出血，甚至腹泻，脱水多尿，伴随蛋白尿和糖尿。妊娠母畜子宫黏膜出血，往往发生流产。

中毒后的病理变化以肾脏为主，可见肾脏肥大，呈灰白色，表面凹凸不平，有小泡，肾实质坏死，肾皮质间隙细胞纤维化；近曲小管功能退化，肾小管通透性变差，浓缩能力下降。鸡血浆总蛋白、白蛋白和球蛋白含量下降。OTA的慢性中毒还表现为凝血时间延长，骨骼完整性差，肠道脆弱及肾脏受损等。

OTA在单胃动物体组织内、及相应的畜产品内有残留。食物中的OTA与一种致命的地方性肾脏疾病（balkanendemicnephropathy）有关，且有致癌、致畸作用，近年来引起了人类营养学家的重视。其中鸡和猪血液、肝脏、肾脏、肌肉和脂肪组织中均有OTA残留（鸡蛋中的残留量很低）的报道，以血液中的残留浓度最高，肾脏、肝脏、肌肉和脂肪组织次之。研究表明，组织中OTA残留量与其在饲料中的含量有明显的相关关系。而Egmond（1994）在反刍动物组织及其乳中未检测到OTA。

产生赭曲霉毒素A的霉菌广泛分布于自然界，导致赭曲霉毒素A广泛分布于各种食品和饲料中。在寒带和温带地区如欧洲和北美洲，赭曲霉毒素A主要来源于青霉属的疣孢青霉；在热带地区，该毒素主要来源于赭曲霉。近年来发现，水果及果汁中的赭曲霉毒素A主要由碳黑瞌霉和黑曲霉产生。动物食用了含有赭曲霉毒素A的饲料，在其内脏、组织及血液中含有大量的赭曲霉毒素A

发现动物中毒后，首先要停止饲喂霉变饲料，并更换易消化且富含维生素的饲料。对病情严重的动物要对症治疗，防止脱水和保护肝脏。Creppy等（1980）报道，注射苯丙氨酸对OTA急性中毒症有疗效。

在水分含量高的（18%~24%）饲料中，添加由挥发性脂肪酸组成的防霉剂有一定的防霉效果。

OTA对热极其稳定，通过加热脱毒的效果较差。Deberghes等（1995）报道，0.5%胆胺（cholestyramine）、γ射线和紫外线照射可以起到一定的脱毒效果。

OTA与OTB在羧基肽酶A和糜蛋白酶的催化下，可水解成苯丙氨酸和毒性较小的Oa，其中OTB的酶解速度是OTA的6～7倍，瘤胃微生物有很强的类似反应活性。De-berghes等（1995）在赭曲霉菌培养液中加入5单位的羧基肽酶，培养18天，与对照组相比，OTA产量由73.6ng/ml下降到零。由此推测，这将是有开发前途的OTA脱毒方法。

Hult等（1976）报道，瑞土规定猪和禽配合饲料中OTA的允许量分别不得超过200μg/kg和1000ug/kg。美国也正在制订有关条例。其他国家尚未见有关OTA的允许量规定。国内GB 2761-2011规定谷物、豆类及其制品中OTA的允许量不得超过5μg/kg。

赭曲霉毒素A（OchratoxinA）是赭曲霉毒素（Ochratoxins）家族中最重要的毒素，由多种曲霉菌（赭曲霉）和青霉菌（疣孢青霉）产生，这些霉菌也产生桔霉素和草酸。赭曲霉毒素普遍存在于热带和气候温和的地区，常现于燕麦，大麦，小麦和玉米农作物上。这些霉菌具有产生高达10ppm赭曲霉毒素A的能力。这样高水平的赭曲霉毒素是很少见的，即使毒素水平很低的情况下，如0.2ppm，就可对养猪生产造成危害性影响（Krogh，1991）。

单胃动物采食被赭曲霉毒素污染的饲料可导致其组织器官，脂肪，肌肉组织和血液被毒素污染。如果猪长时间地采食赭曲霉毒素污染的饲料，霉菌毒素可污染猪的大部分可食组织，导致肾脏损伤和猪肉胴体等级降低。赭曲霉毒素急性中毒症（日粮毒素水平高于5ppm）的特点是肾病（肾功能衰竭），肠炎脂肪肝，淋巴结坏死，免疫抑制，并伴随着其他多种病理症状。由于急性肾衰竭，急性的赭曲霉毒素中毒症有可能导致动物死亡。鉴于赭曲霉毒素可在动物可食肌肉组织中积累，进而导致人类健康问题的特性，研究人员近期将研究重点关注于赭曲霉毒素的致癌性方面。事实上，丹麦养猪业以肾脏赭曲霉毒素水平作为判定猪肉产品是否存在潜在的毒素危害残留的指标。临床症状和剖检可显示赭曲霉毒素中毒症，这还可通过监测饲料中的霉菌毒素或在屠宰场检测肾脏中的毒素水平确认赭曲霉毒素的中毒症。

由于赭曲霉毒素在血清中的半衰期相当长（72-120小时），猪只对赭曲霉毒素的污染十分敏感。研究人员近期在加拿大和欧盟，包括德国，挪威，波兰，瑞典以及前南斯拉夫对猪血液中的天然污染物赭曲霉毒素进行了检测调查。同时，在美国、奥地利、比利时、丹麦、芬兰、德国、波兰、瑞士、英国和前南斯拉夫的调查结果显示，赭曲霉毒素也出现在猪的肾脏中。

残留在动物产品中的赭曲霉毒素可通过食品链传递给消费者，一些国家的政府已采取强硬的监管措施，以消除消费者对猪肉产品安全性的担忧。例如，欧洲于1997年设立了所有食品中赭曲霉毒素的最高允许含量为5ppb。德国将这一标准更严格地定为3ppb。在丹麦，如果猪血液赭曲霉毒素的水平达到25μg/mL，认定为猪的整个胴体被污染，猪肉不得作为食用。

临床影响

赭曲霉毒素中毒症的主要症状为：生长迟缓，饲料效率降低。肝脏受损，但主要是对肾脏的影响，导致肾间质纤维化。饮水量增加（剧渴），导致排尿增多（多尿症），这是赭曲霉毒素中毒症的一大特点。幼龄生长猪会出现肾周水肿，并伴有僵硬。胃溃疡也是常见的症状。公猪的精子质量降低，受精率下降，最终导致整体繁殖性能下降。

中毒者的临床表现

生产性能下降（饲料采食量，生长速度，饲料效率）

肾脏苍白、变大=肾小管变性，肾间质纤维化

肾功能受损=高蛋白血症，氮血症

肾衰竭=死亡

饮水量增加（剧渴），排尿增多（多尿症）

细胞免疫抑制=对感染的易感性大大增加

公猪精子质量降低=受精率下降=繁殖性能降低

仔猪出现水肿=弓背僵直，步调失调

胃溃疡

1主题内容与适用范围

本标准规定了谷物和大豆中赭曲霉毒素A的薄层色谱测定方法。

本标准适用于小麦、玉米和大豆中赭曲霉毒素A的测定。

在薄层板上赭曲霉毒素A的最低检出量为4ng。该方法的最低检测量为10μg/kg。

2原理

用三氯甲烷-0.1mol/L磷酸或石油醚-甲醇/水提取样品中的赭曲霉毒素A，样品提取液经液-液分配后，根据其在365nm紫外光灯下产生黄绿色荧光，在薄层色谱板上与标准比较测定含量。

3试剂

以下试剂除特殊规定外均为分析纯试剂，水为蒸馏水或同等纯度的水。

⒊1石油醚（60～90℃或30～60℃）。

⒊2甲醇。

⒊3三氯甲烷。

⒊4甲苯。

⒊5乙酸乙酯。

⒊6甲酸。

⒊7冰乙酸。

⒊8乙醚。

⒊9苯-乙腈（98：2）。

⒊100.1mol/L磷酸[c（H3PO4）=0.1mol/L]：称取11.5g磷酸（85%）加水稀释至1000mL。

⒊112mol/L盐酸溶液[c(HCL)=2mol/L]：量取20mL盐酸，加水稀释至120mL。

⒊124%氯化钠溶液。

⒊130.1mol/L碳酸氢钠溶液[c（NaHCO3）=0.1mol/L]：称取8.4g碳酸氢钠，加适量水溶解，并用水稀释至1000mL。

⒊14硅胶G：薄层层析用。

⒊15赭曲霉毒素A（以下简称OA）标准溶液：用苯-冰乙酸（99：1）配成40μg/mL赭曲霉毒素A贮备液，并用紫外分光光度计测定其浓度。浓度的测定参照GB5009.22《食品中黄曲霉毒素B1的测定方法》中2.14条（赭曲霉毒素A的最大吸收峰波长333nm，分子量403，克分子消光系数值为5550）。精密吸取贮备液，用苯稀释成每毫升含赭曲霉毒素A0.5μg，赭曲霉毒素A标准液应置冰箱中避光保存。

4仪器

所有玻璃仪器均需用稀盐酸浸泡，用自来水，蒸馏水冲洗。

⒋1小型粉碎机。

⒋2电动振荡器。

⒋3玻璃板：5cm×20cm。

⒋4薄层涂布器。

⒋5展开槽：内长25cm、宽6cm、高4cm。

⒋6紫外光灯：365nm。

⒋7微量注射器：10μL、50μL。

⒋8具0.2mL尾管的10mL，小浓缩瓶。

5分析步骤

⒌1提取

⒌1.1甲法

称取20g粉碎并通过20目筛的样品，置于200mL具塞锥形瓶中，加入100mL三氯甲烷和10mL0.1mol/L磷酸，振荡30min后通过快速定性滤纸过滤；取20ml，滤液置于250mL分液漏斗中，加50mL0.1mol/L碳酸氢钠溶液振摇2min，静置分层后，将三氯甲烷层放入另一个100mL分液漏斗中（少量乳化层，或即使三氯甲烷层全部乳化都可放入分液漏斗中），加入50mL0.1mol/L碳酸氢钠溶液重复提取三氯甲烷层，静置分层后弃去三氯甲烷层（如三氯甲烷层仍乳化，弃去，不影响结果）。碳酸氢钠水层并入第一个分液漏斗中，加约5.5mL2mol/L盐酸溶液调节pH2～3（用pH试纸测试），加入25mL三氯甲烷振摇2min，静置分层后，放三氯甲烷层于另一盛有100mL水的250mL分液漏斗中，酸水层再用10mL三氯甲烷振摇、提取、静置，将三氯甲烷层并入同一分液漏斗中。振摇、静置分层，用脱脂棉擦干分液漏斗下端，放三氯甲烷层于一75ml蒸发皿中，将蒸发皿置蒸汽浴上通风挥干。用约8mL三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解，转入具尾管的10mL浓缩瓶中，置80℃水浴锅上用蒸汽加热吹氮气（N2），浓缩至干，加入0.2mL苯-乙腈（98：2）溶解残渣，摇匀，供薄层色谱点样用。

⒌1.2乙法

称取20g粉碎并通过20目筛的样品加于200mL具塞锥形瓶中，加30mL石油醚和100mL甲醇-水（55：45），在瓶塞上抹上一层水盖严防漏。振荡30min后，通过快速定性滤纸滤入分液漏斗中，待下层甲醇水层分清后，取出20mL滤液置于100mL分液漏斗中，用pH试纸测试，一般为pH5～6。加入25mL三氯甲烷振摇2min，静置分层后放出三氯甲烷层于另一分液漏斗中，再用10mL三氯甲烷重复振摇提取甲醇-水层（在用三氯甲烷振摇提取时，如发生乳化现象，可滴加甲醇促使其分层），将三氯甲烷层合并于同一分液漏斗中，加入50～100mL4%氯化钠溶液（加入量视品种不同而异，大豆加100mL，小麦、玉米则加50mL左右），振摇放置（如为大豆样品提取液还须轻轻反复倒转分液漏斗，使乳化层逐渐上升。如乳化严重可加入少许甲醇），待三氯甲烷层澄清后，用脱脂棉擦干分液漏斗下端，放三氯甲烷层于75mL蒸发皿中（如为大豆样品须再加入10mL三氯甲烷振摇，三氯甲烷层合并于同一蒸发皿中），将蒸发皿置蒸汽浴上通风挥干。

以下操作自“用约8mL三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解”起，按甲法操作。

⒌2测定

⒌2.1薄层板的制备

称取4g硅胶G，加约10mL水于乳钵中研磨至糊状。立即倒入涂布器内制成5cm×20cm,厚度0.3mm的薄层板三块，在空气中干燥后，在105～110℃活化1h，取出放干燥器中保存。

⒌2.2点样取两块薄层板，在距薄层板下端2.5cm的基线上用微量注射器滴加两个点：在距板左边缘1.7cm处滴加OA标准溶液8μL（浓度0.5μg/mL），在距板左边缘2.5cm处滴加样液25μL，然后在第二块板的样液点上加滴OA标准溶液8μL（浓度0.5μg/mL）。点样时，需边滴加边用电吹风吹干，交替使用冷热风。

⒌2.3展开

⒌2.3.1展开剂

横展剂：乙醚或乙醚-甲醇-水（94：5：1）。

纵展剂：

a.甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（6：3：1.2：0.06）或甲苯-乙酸乙酯-甲酸（6：3：1.4）；b.苯-冰乙酸（9：1）。

⒌2.3.2展开

横向展开：在展开槽内倒入10mL横展剂，先将薄层板纵展至离原点2～3cm，取出通风挥发溶剂1～2min后，再将该薄层板靠标准点的长边置于同一展开槽内的溶剂中横展，如横展剂不够，可添加适量，展至板端过1min，取出通风挥发溶剂2～3min。

纵向展开：在另一展开槽内倒入10mL纵展剂，将经横展后的薄层板纵展至前沿距原点13～15cm。取出通风挥干至板面无酸味（约5～10min）。

⒌2.4观察与评定

将薄层色谱板置365nm波长紫外光灯下观察。

a.在紫外光灯下将两板相互比较，若第二块板的样液点在OA标准点的相应处出现最低检出量，而在第一板相同位置上未出现荧光点，则样品中的OA含量在本测定方法的最低检测量10μg/kg以下。

b.如果第一板样液点在与第二板样液点相同位置上出现荧光点则看第二板样液的荧光点是否与滴加的标准荧光点重叠，再进行以下的定量与确证试验。

⒌2.5稀释定量

比较样液中OA与标准OA点的荧光强度，估计稀释倍数。

薄层板经双向展开后，当阳性样品中OA含量高时，OA的荧光点会被横向拉长，使点变扁，或分成两个黄绿色荧光点。这是因为在横展过程中原点上OA的量超过了硅胶的吸附能力，原点上的杂质和残留溶剂在横展中将OA点横向拉长了，这时可根据OA黄绿色荧光的总强度与标准荧光强度比较，估计需减少的滴加微升数或所需稀释倍数。经稀释后测定含量时，可在样液点的左边基线上滴加二个标准点，OA的量可为4ng、8ng，比较样液与两个标准OA荧光点的荧光强度，概略定量。

⒌2.6确证试验

用碳酸氢钠乙醇溶液（在100mL水中溶解6.0g碳酸氢钠，加20mL乙醇）喷洒色谱板，在室温下干燥，于长波紫外光灯下观察，这时OA荧光点应由黄绿色变为蓝色，而且荧光强度有所增加，再估计样品中OA，如果与喷洒前情况不一致，要利用喷洒前所做的估计。

6计算

样品中赭曲霉毒素A的含量可按下式计算。

V11000

x=A×━━×D×━━━

V2m

式中x──样品中赭曲霉毒素A的含量，μg/kg;

A─-薄层板上测得样液点上OA的量，μg;

D──样液的总稀释倍数；

V1─-苯-乙腈混合液的体积，mL；

V2──出现最低荧光点时滴加样液的体积，mL；

m─-苯-乙腈溶解时相当样品的质量，g。

7精密度

该方法经五个协作者验证，在OA加入量分别为10,50,100μg/kg水平、每个水平n=2时，方法的回收率用X表示、精密度用SD表示：

小麦分别为93±10.23；92±14.72；105±38.85。玉米分别为88±9.68;88±9.68;103±41.2。[上述数据为（X±SD）%]