1904年他把酵母提取物放入一个由半渗透薄膜制成的袋内，并将此袋放入纯水中。这样，酵母提取物中的小分子便通过薄膜进入水中，而大分子则因不能通过薄膜而留在袋内。这一过程称为渗析。这种渗析技术起源于格雷姆时代。哈登发现，当他这样处理时，酵母酶的活性消失，它不再使糖发酵了。然而，如果他将渗析至袋外的水加入袋内的物料中，则活性又恢复。看来，酵母酶似乎是由两部分组成的，一部分是小分子，另一部分则是大分子。如果将袋内的物料煮沸，则活性消失，即使袋内加入了袋外之水也是如此。因此，大部分分子多半是蛋白质。小分子经受住了煮沸，因而多半不是蛋白质。后者是“辅酶”的第一个实例，它是一种不是蛋白质的小分子，这种小分子对于酶的作用是不可少的，而酶本身则是一种蛋白质。奥伊勒-凯尔平等研究了辅酶的化学性质，并弄清了下述事实：维生素对于生命之所以重要是由于它们组成了辅酶的一部分；维生素是由艾克曼首先发现的。酶是一种催化剂，由于酶只需要微小的剂量，所以辅酶、维生素也只需要微小的剂量。这就说明了为什么某种物质对生命来说是必不可少的，但对这种物质的需要量却是痕量的。铜、钴、锰和钼这些矿物质只需要痕量这个事实也可以用同样的理由解释。它们也是辅酶的一部分。哈登注意到了另外一件有趣的事情。开始时，酵母提取物非常迅速地将葡萄糖分解并产生二氧化碳，但是随着时间的推移，其活性逐渐降低。因此，人们很自然地认为，酶是随着时间的推移而逐渐分解的。然而，哈登在1905年证明实际情况不是这样的。如果把无机磷酸盐加入溶液中，则酶又恢复到原来的活性。这是一个奇妙的发现，因为被发酵的糖，产生出来的酒精和二氧化碳以有酶本身都不含磷。由于无机磷酸盐消失了，所以哈登就寻找由无机磷酸盐形成的有机磷酸盐，结果发现一个糖分子上附着两个磷酸盐基团这样的结构形式。在发酵过程中，就形成了这样的糖分子，此后，在发生了许多其他的化学反应之后，这两个磷酸盐基团又脱离了糖分子。这是对中间代谢作用进行研究的开端；研究中间代谢作用，就是要探索在活组织内不断发生着的各种化学反应过程中生成的许多作为中间体的化合物，这些中间体有时存在的时间非常短暂。