佟养正出身辽东将门世家，其祖父佟恩、父亲佟登均为明朝将领，其中祖父战死沙场，父亲官至总兵。他既沿袭尚武家风，又兼通文学，于万历八年（1580年）中武进士。此后被授为镇武堡游击，在万历十四年（1586年）四月随李成梁出塞，于可母林大破蒙古军。同年九月，明廷于复州置参将，十一月佟养正调任此职。万历十六年（1588年），他因多次随李成梁征讨蒙古、女真诸部及练兵有方而被辽东巡抚顾养谦列入应予“荐扬录用”人员的名单。

万历二十年（1592年）二月，佟养正调任分守辽东宽奠等处副总兵、都指挥使。同年，日本侵略明朝属国朝鲜（壬辰倭乱），朝鲜国王李昖一路逃至鸭绿江畔的义州，并遣使向上国明朝告急。在明朝接到日军侵朝的消息后，佟养正奉命亲率士卒在鸭绿江西岸建设墩台、堑壕等防御工事，又在朝鲜国王还在赶赴义州途中的六月十一日来朝鲜义州，要求朝鲜及时飞报日军消息，在向明朝传递战争情报及联络朝鲜的过程中发挥重要作用。明军参战后，他“以本府主镇总兵，军前机务、兵马刍粮等事，无不管辖，克殚心力，靡有缺乏”，尽职于抗倭援朝的后勤工作。他负责给朝鲜军发放军粮，又请求明廷许可在朝鲜境内开市，还让中国匠人教习朝鲜人开采银矿，当然他也曾亲自率军应援。因此他晋阶为神枢营副将、后军都督佥事，朝鲜也对他评价极高。朝鲜国王李昖曾抱怨东来明将“无可观者”，但将佟养正与骆尚志、吴惟忠作为仅有的三员值得肯定的明将。