更新时间：2022-06-14 23:21
体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞系统，它操作简便，周期短，收益大，表达产物稳定，但是表达基因的分子量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工作用。真核细胞系统包括COS 细胞、CHO细胞、酵母细胞和昆虫细胞等表达系统。昆虫细胞表达系统（即杆状病毒表达系统）独特的生物学特性，日益受到人们的重视。昆虫细胞培养及操作较简便，成本低，因此被广泛用于生产基因工程产品。本文就该系统的特性、技术方法以及应用新进展作一综述。
杆状病毒（又称多角体病毒或颗粒体病毒）有两类病毒体[1]，芽殖病毒体（buded virion，BV）和多角体源性病毒体（polyhedron derived virion,PDV）。在病毒复制过程中，首先产生BV，BV核壳产生后通过芽生方式从细胞中释放出来，再感染其它细胞，复制后期产生PDV，PDV核壳产生后在细胞核内获得包膜，再被包被在蛋白质包含体中，直到细胞裂解后才被释放到周围环境中，再感染其它细胞。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核内复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣壳内，后者具有较大的柔韧性，可以容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究工作进展迅速，其中研究最多的是苜蓿银纹夜蛾NPV(AcNPV)。该种杆状病毒在昆虫细胞核内复制的两个显著方面就是形成BV和PDV。AcNPV的基因表达分为4个阶段[2]：立早期基因表达，早期基因表达，晚期基因表达和极晚期基因表达。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白。多角体蛋白是形成包含体的主要成分，相对分子质量约为29 000,感染后期在细胞中的累积可高达30%～50%，是病毒复制非必需成分，但对于病毒粒子却有保护作用，使之保持稳定和感染能力。另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，它也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。p10基因和多角体基因现在都已被定位、克隆和测序。这两个基因启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统的理想的外源基因插入位点。
杆状病毒基因组十分庞大，不能直接对其进行操作插入外源基因，因此需要通过中间转染载体而获得重组杆状病毒。经过十多年来研究者们的不断探索，已构建出用于表达不同基因产物的各种转移载体。这些转移载体的共同特征是[3]：①在一个基础质粒（如pUC系列）中插入一个多角体蛋白基因启动子（或p10基因启动子）；②启动子下游为一个多克隆位点区,其两侧含有与杆状病毒多角体基因同源的侧翼序列；③重组转染载体与野生型病毒AcNPV DNA共转染昆虫细胞，通过多角体蛋白基因启动子两端的侧翼同源序列与AcNPV DNA在胞内发生同源重组，使多角体基因被外源基因取代，而将外源基因整合到病毒基因组的相应位置，这样就获得了重组的杆状病毒。
杆状病毒转染载体大致可分为下面3类；
用于表达融合型蛋白的转染质粒
是一类早期构建的转染质粒，它包括pAC系列[4],如pAC101、pAC311、pAC360等。在每个载体中，多角体蛋白基因启动子下游ATG启始密码后含有一个单一的BamHⅠ酶切位点，当外源基因和多角体基因的读码框架正确时，就可以获得含1个或几个多角体蛋白N端氨基酸的融合型外源基因。
用于表达单一非融合蛋白的转染质粒
由于外加的多角体蛋白或其它的氨基酸可能对外源蛋白的生物活性或细胞定位产生影响，所以用于表达非融合型蛋白的转移载体被广泛应用。几种不同的策略被用于设计高水平表达非融合蛋白的转移载体：
(1)如pAcRP[5]系列等，都在多角体基因启动子启始密码ATG上游引入一个单一的限制性多克隆位点；
(2)如pAcYM1[6]和pEV55及其衍生物中都含有所有的多角体基因上游非翻译序列（包括启始密码子ATG中的A以及其后跟着的单一限制性克隆位点或多克隆位点），这样就可以避免由于5′端非翻译前导序列的缺失而影响mRNA的稳定性；
(3)如pVL941、pVL1392、pVL1393[7]等，是将融合载体pAC311多角体基因启动子下游启始密码ATG改变为ATT。这样，插入的外源基因必须含有自身的ATG，并从此开始翻译，而多角体基因启动子驱动的mRNA转录后产物稳定水平不受影响。
用于表达多个非融合蛋白的转染载体
这种载体的主要特征是含有2个或2个以上相同的启动子，可表达2条或2条以上多肽链的蛋白。
如Emery和Bishop[8]等构建的pAcVC2转染质粒，含有两个方向相反的多角体基因启动子。重组病毒可同时表达多角体蛋白和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV） N蛋白。Takehara[9]等构建了可插入两种外源基因的双重表达载体。该类载体也是利用两个相同的多角体基因启动子，使获得的重组病毒同时表达两种产物。Takehara等因此成功地表达了HBVsAg和HBeAg。
利用重组转染载体与野生型AcNPV DNA共转染细胞后获得重组病毒的频率是非常低的，通常只有0.2%～ 5%[10]。这样就为筛选重组病毒的工作困难，为了提高重组效率，研究者们进行了一些探索：
（1）线性化AcNPV DNA：Kitts等[11]首先提出了将AcNPV DNA进行线性化处理。因为线性化的AcNPV DNA感染宿主细胞的能力很低，当与重组转移质粒发生同源重组后，原来线状的 AcNPV DNA即可自身环化，感染细胞的能力恢复，因此感染昆虫细胞的病毒绝大多数为重组病毒，这样使重组频率可提高到30%；
（2）致死缺陷型病毒：由Pharmingen公司[10]推出的BaculoGoldTM系统就是一个含致死缺陷型的线性AcNPV DNA。这种系统的DNA在多角体蛋白基因下游1.7 kb范围内的一段复制必需基因被去除，致使这种DNA转染包装细胞后不能复制成成熟的病毒粒子。当把重组转染质粒与其转染昆虫细胞后，外源基因修复了缺失部分，病毒被复活可形成具有感染能力的病毒体，再感染其它的昆虫细胞。这种DNA与转染质粒的重组效率可提高到85%～99%。
由于在重组病毒中多角体基因被外源基因所取代，因此形成的子代病毒不含有包含体，为包含体阴性病毒。包含体阴性病毒与包含体阳性病毒(由野生型病毒形成)在平板中形成的空斑形态是不同的。因此，可在光学显微镜下，利用这一特征筛选出含外源基因的重组病毒并加以纯化[12]。这正是目前使用最普遍的有效方法。
Vialard等[13]构建了一种含β-半乳糖苷酶标记的pJVNheI转染质粒，该质粒是在多角体基因启动子上游插入一个p10基因启动子，由它来驱使lacZ基因表达，当这种重组转染质粒与病毒DNA共转染昆虫细胞后得到的重组病毒即可在含X-gal的细胞培养物中形成蓝色噬斑，使筛选工作更加容易。因此得到提示，如果先构建出含lacZ的重组病毒，在此基础上再构建出含外源基因的重组病毒，将使筛选变得很容易。
如有限稀释法[3]、DNA斑点杂交[3]也可用于筛选重组病毒，缺点在于不能精确地筛选出来源于单一重组病毒的毒株。
2003年英国University of Reading的Ian M. Jones首次通过在Bacmid上部分敲除Orf1629，构建了免空斑筛选的Bacmid。免除空斑筛选后，构建重组杆状病毒的时间由以前的大约三周迅速降低到一周。目前采用这种策略的有OET的FlashBAC和Bacmid Ltd.的qBac.
在杆状病毒系统中，要获得蛋白质的有效表达，首先要选择合适的转染载体。依据表达的蛋白质属融合型或非融合型，选择单启动子型或多启动子型。另外目的基因的选择要注意以下因素：①该目的基因应不含内含子；②去除其mRNA 5′端非编码区的异源序列；③翻译启始密码子AUG应处于适当的序列之间（如Kozak 序列），通常认为其上游 -3位的碱基为A时最佳；④去除mRNA 3′端的非编码区的非必需序列；⑤若用非融合型转移载体，基因需含自身的ATG启始密码，若用融合型转移载体则不必带上；⑥转移载体中已含有多聚腺苷酸加尾信号，外源基因无需再带上这类信号；⑦如果表达产物的信号肽不能被杆状病毒表达体系有效去除时，可考虑去除这类信号肽；⑧若表达产物不能稳定表达时，可对其N端进行改造或表达融合蛋白。
除此以外，细胞的种类和生理状态也是重组病毒繁殖的关键因素。蛋白质的低水平表达可能还与转录后加工、蛋白质转运、以及蛋白质本身的性质相关，可以采用融合表达来解决。
用杆状病毒做载体，可高效表达外源基因，到目前为止已有几百个包括动植物、病毒、细菌、真菌的基因在昆虫细胞或幼虫体内得到高效表达。这个表达体系的主要特点是可以获得大量抗原性、免疫原性较好的，与天然蛋白功能相似的可溶性重组蛋白。这一特点优于细菌、酵母和哺乳动物细胞表达体系。重组杆状病毒感染昆虫细胞后，可以对外源蛋白进行许多真核细胞的转录后加工作用，包括糖基化、磷酸化、酰基化、正确的信号肽切割、蛋白水解以及适当的折叠作用，而且还可将重组蛋白聚集定位于天然蛋白的同一细胞器上，还能进行适当的寡聚化装配。因此是表达有生物活性的蛋白质的理想载体。
由于这个载体系统独特的性质，使其被广泛地应用于药物开发、疫苗、促生长因子、癌基因、抑癌基因蛋白产物、某些致瘤病毒蛋白、免疫活性分子、基因表达调控等多个领域的研究中。重组杆状病毒的高效表达为获得大量的类原型蛋白及其功能研究提供了可能。对于某些寡聚蛋白而言，若只表达其中某一成分并不能获得非常好的抗原性和免疫原性，因为这些特性不仅体现在蛋白质一级结构中，而且还与蛋白质的空间构象、多个蛋白成分的相互作用有密切关系。因此，若能通过表达多个蛋白成分，并使之在特定环境中进行寡聚化装配，获得蛋白有效的空间构象，必然对提高免疫反应的敏感性，了解蛋白成分的相互作用极为有利。所以，近年来利用该系统表达寡聚蛋白质的研究尤其引人瞩目。Roy等[14]在1996年采用杆状病毒多启动子表达载体成功的进行了蓝舌病毒（BTV）外壳蛋白VP3、VP7、VP2、VP5的共表达，发现当VP3、VP7共表达时可形成BTV类核心颗粒，而同时表达4种成分时可形成不含病毒核酸的类病毒颗粒（VLP）。VLP的获得对了解病毒蛋白在细胞中的装配过程和研究各蛋白质间的相互作用奠定了基础，更重要的是这类VLP与天然病毒粒子有极为相似的空间结构，这种特定的构象必然具有较好的抗原性和免疫原性。VLP的研究为发展有效的基因工程疫苗和敏感的诊断试剂提供了新的思路。杆状病毒具有多种优点，是十分有发展前景的表达系统。目前，研究及应用最多的杆状病毒系统为AcNPV，尽管它可感染30多种细胞，但主要在Sf细胞中繁殖，因此，对于其它细胞是否易感，以及外源蛋白表达水平、转录后加工等问题还需进行深入研究。如果在产物纯化过程中有昆虫细胞蛋白的掺入，则可能在应用时引起哺乳动物的过敏反应，因此，如何纯化产物，使其导致的过敏反应降到最低限度是十分值得重视和探讨的问题。